三果汤（Triphala）又名哲布松散，由诃子Chebulae Fructus、毛诃子Terminaliae Belliricae Fructus和余甘子Phyllanthi Fructus组成[1]。三果汤含片（Triphala Buccal Tablets，TBT）是藏药“哲布松汤”的剂型改良新药，具有清热生津、润燥利咽的功效[2]。3味中药均富含多酚，具有强烈的涩味刺激；同时，由于口含片剂型的特殊性，涩味刺激在口腔久久难以消散，严重影响患者的服药顺应性。
多酚与唾液蛋白相互作用是重要的涩味来源，两者相互作用水平具有很强的涩味预测能力[3-4]。前期研究发现多酚浓度、多酚结构、多酚pH、反应温度、反应时间等均能影响多酚与唾液蛋白的结合作用[5-7]。通过对TBT处方、口腔反应微环境和实际服药过程分析，认为药物pH是制剂环节可调节的最优因素。因此，本研究从pH调控多酚-唾液蛋白相互作用的角度，开展TBT的涩味掩蔽方法研究。
1仪器与材料
1.1仪器
Cary Eclipse型荧光分光光度计，美国Varian公司；UV-1700型紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Turbiscan LAB型稳定性分析仪，法国Formulation公司；雷磁PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；YD-20型片剂测试仪，京塔科技有限公司；ZB-1E型智能崩解仪，天津市天大天发科技有限公司；α-Astree II型电子舌，法国Alpha MOS公司；Agilent 1260高效液相色谱仪，美国Agilent科技公司；BSA224S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司。
1.2药物与试剂
诃子、余甘子、毛诃子饮片均购于成都荷花池中药材市场，经成都中医药大学药学院许润春副教授鉴定，分别为使君子科榄仁树属植物诃子Terminalia chebula Retz.的干燥成熟果实，大戟科叶下珠属植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥成熟果实，使君子科榄仁树属植物毗黎勒T. bellirica(Gaertn.) Roxb . 的干燥成熟果实。
β-酪蛋白，质量分数≥98%，批号SLBN8470V，购于Sigma-Aldrich公司；对照品没食子酸，批号4051109，质量分数≥98%，购于成都普瑞法科技开发有限公司；L-谷氨酸单钠盐（批号H31A6R2860）、硫酸奎宁一水物（批号YM0317BA14）、薄荷脑（批号JM0524RB13）、阿司帕坦（批号WM0327DY13）、三氯蔗糖（批号JA0427RA13）均购于上海源叶生物科技有限公司；氯化钠、鞣酸购于成都市科龙化工试剂厂，可溶性淀粉、柠檬酸、蔗糖购于西陇化工股份有限公司，糊精购于天津市恒兴化学试剂制造有限公司，以上试剂均为分析纯；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-nitro-henylhydrazine，DPPH），质量分数＞98%，购于美国Sigma公司；金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus（ATCC6538）、白色念珠菌Canidia albicans（ATCC10231）由江西中医药大学提供。
2方法与结果
2.1多酚-唾液蛋白结合反应
2.1.1空白人工唾液的制备为保持反应环境与人体口腔的一致性，选择人工唾液作为反应介质。人工唾液配方采用ISO/TR10271标准[8]，组成为NaCl 0.400 g，KCl 0.400 g，NaH 2PO 4·2H 2O 0.780 g ，Na 2S·2H 2O 0.005 g ，CaCl 2·2H 2O 0.795 g ，尿素1 g，溶于1000 mL去离子水，调整pH至6.8，4 ℃保存。
2.1.2含β-酪蛋白唾液的制备唾液蛋白受时间、食物摄取、昼夜节律、年纪、性别、健康情况、用药情况等因素影响，为建立稳定的研究模型，通常采用单一蛋白进行模拟。选择唾液蛋白中与多酚作用结合力最强的富含脯氨酸蛋白（PRPs）代表β-酪蛋白作为模型蛋白[9]。唾液中蛋白含量为0.1%～0.2%，PRPs约占总蛋白的70% [10]，因此，本实验设置β-酪蛋白唾液质量浓度为1.2 mg/mL。
2.1.3三果汤提取物的制备按照1.5∶1.2∶1比例称取诃子、余甘子、毛诃子，加12倍量去离子水，浸泡40 min，加热回流1.5 h，滤过。滤渣加12倍量去离子水回流1.5 h，合并滤液，浓缩，干燥，制得浸膏粉末，收率48.4%。
2.2 pH值对三果汤-唾液蛋白作用的影响
2.2.1 不同pH值三果汤样品制备取适量三果汤提取物，经人工唾液溶解至0.4 mg/mL，测得pH为3.5。用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液调节pH至2.5、3.5、4.5、5.5、6.5。前期实验表明，三果汤pH在7.5和8.5时，虽然涩味明显减弱，但前期预实验结果显示化学成分发生明显变化，因此，不设置碱性样品。
2.2.2荧光淬灭光谱测定采用荧光淬灭法测定不同pH值三果汤与β-酪蛋白的相互作用。分别将0、10、20、40、80、100、200、400、600、1000 μL三果汤样品与1 mL含β-酪蛋白唾液混合，并用人工唾液定容至2 mL，混匀。由于三果汤化学成分复杂，为方便参数计算，选择含量较高的没食子酸作为代表。以其摩尔质量170.12 g/mol计算，三果汤含没食子酸浓度分别为0.024 2、0.048 4、0.096 9、0.193 7、0.242 2、0.484 4、0.968 7、1.453 1、2.421 8mmol/L。30 ℃水浴反应10 min后取出，置于荧光分光光度计检测，设置激发波长为280 nm，扫描287～450 nm的发射光谱，观察荧光强度的变化。340 nm处的荧光强度用于相互作用过程参数计算。采用相同方法扫描在20 ℃反应时的发射光谱，观察荧光强度。
2.2.3荧光淬灭光谱
（1）荧光光谱与淬灭常数：β-酪蛋白在不同pH值条件下，与不同浓度三果汤提取液作用的荧光光谱见图1。随着三果汤浓度的增加，β-酪蛋白的荧光强度减小。表明三果汤与β-酪蛋白相互作用，淬灭了蛋白的内部荧光。同时，高浓度的三果汤（大于0.968 7 mmol/L）几乎完全淬灭β-酪蛋白的内源荧光，表明三果汤非常接近于β-酪蛋白的荧光发射氨基酸残基。淬灭常数（K）代表淬灭剂对荧光分子的接触程度和反应速度。根据以下方程计算。
F0/( F 0 －F)＝1/( fK [ Q ]) ＋1/ f
F0为β-酪蛋白初始荧光强度，F为淬灭剂存在时的荧光强度，[ Q ] 为淬灭剂的摩尔浓度，f为极性淬灭剂荧光分数[15]
F0/( F 0－F)与1/[ Q ] 的拟合曲线见图1，三果汤对β-酪蛋白的接触速度和反应速度均较高。通过比较K值，不同pH值三果汤与蛋白的接触程度与反应速度排序为pH 3.5≈pH 2.5＞pH 5.5＞pH 4.5≈pH 6.5。其中，pH 4.5和pH 6.5三果汤与β-酪蛋白的接触反应速度明显弱于原提取液（pH 3.5）。
（2）荧光淬灭机制：荧光分子与淬灭剂之间的淬灭效率都遵循Stem-Volmer方程。
F0/ F ＝1＋Kqt0[ Q ] ＝1＋KD[ Q ]
F0、F和[ Q ] 代表含义与前面相同，KD为Stern-Volmer常数，Kq为双分子淬灭过程的速率常数，t0为在没有淬灭剂存在下荧光分子的平均荧光寿命（β-酪蛋白为3.30 ns）[16]；以F0/ F 对[ Q ] 作图，得一纵轴截距近似1的直线，其斜率为KD
三果汤与β-酪蛋白作用的Stem-Volmer曲线见图2。Kq随着温度的升高而增大，说明该过程为动态淬灭。然而，不同pH值三果汤与蛋白结合的Kq值均大于2×10 10L/ (mol·s) （有生物高聚物的不同淬灭剂的最大散射碰撞淬灭常数），表明该过程以形成基态复合物为主的静态淬灭[17]。同时，该Stem- Volmer曲线仅在低浓度成线性，高浓度区域非线性。综上，三果汤与β-酪蛋白的作用是以静态淬灭为主，高浓度时兼有动态淬灭过程。不同pH值三果汤与蛋白结合的Kq排序为pH 5.5＞pH 2.5＞pH 3.5＞pH 6.5＞pH 4.5。
（3）表观结合常数与结合位点数：淬灭剂与蛋白的结合信息可以通过双对数方程反映。
lg[( F 0 －F)/ F ] ＝lg K a ＋nlg[ Q ]
Ka为表观结合常数，n为每个β-酪蛋白分子与三果汤多酚的结合位点数，以lg[( F 0－F)/ F ] 对lg[ Q ] 作图计算得出
结合信息结果见图3。pH 3.5下20 ℃和30 ℃时，三果汤与β-酪蛋白之间的Ka为3.08×10 4L/mol 和1.006×10 5L/mol ，n为1.19和1.32。温度升高，Ka增大，表明三果汤与β-酪蛋白的结合过程有以共价形式存在的相互作用，其中非离子形式起主要作 用。表观结合常数排序为pH 3.5＞pH 5.5＞pH 6.5＞pH 2.5＞pH 4.5。
2.2.4作用体系的稳定性多酚与蛋白的结合是一个可逆过程，为评价荧光淬灭结果的可靠性，测定三果汤-β-酪蛋白作用体系在不同pH值条件下的稳定性。采用基于多重光散射分析法的Turbiscan分析 仪测定，评价指标为Turbiscan稳定性指数（Turbiscan stability index，TSI）[11]。
TSI＝( |scan i ( h ) －scan i －1( h ) |H)
scan i( h ) 为初始扫描时间下样品高度的光强度，scan i－1( h ) 为最后扫描时间样品高度的光强度，H是样品的总高度
取10 mL含β-酪蛋白唾液与2 mL不同pH值三果汤样品于样品管混匀，定容至20 mL，置于扫描池。设定测试参数：温度（25.0±0.5） ℃，间隔 30 s扫描1次，测定时间10 min，电发光二极管在近红外区域（λ＝880 nm）对样品进行扫描。
背散射光谱（图4-A）与稳定性指数（图4-B）结果显示，不同pH值三果汤与β-酪蛋白作用体系10 min内具有较高的稳定性，表明结合作用的可逆性未对荧光淬灭结果造成影响。因此，采用多酚-唾液蛋白作用作为涩味模型具有可靠性。结合荧光淬灭结果，pH 4.5的三果汤与β-酪蛋白结合能力最弱，涩味强度最低，故后续掩蔽方案将三果汤pH调节至4.5。
2.3TBT的涩味掩蔽
2.3.1TBT 的制备按照“2.1.3”项提取工艺制得三果汤提取物，按照制剂生产处方［国家药品标准，NO.WS3-912(Z-247)-2005(Z)］加入适量淀粉、糊精、矫味剂（蔗糖、阿司帕坦、柠檬酸、三氯蔗糖）混匀，制粒。过14目筛网整粒，等量加入硬脂酸镁。将薄荷脑溶于薄荷素油，均匀喷洒到颗粒上。混匀，压制成片，片质量1 g。制得三果汤原含片（TBT1），由于原制剂处方辅料含有0.6%柠檬酸，可能会影响口含片的pH值，故制备不含柠檬酸的三果汤原含片（TBT2）。根据“2.2”项研究结果，调节三果汤pH值至4.5得到涩味掩蔽提取物，后续步骤与前面相同。最终得到三果汤掩味含片（TBT3）、不含柠檬酸的三果汤掩味含片（TBT4）。
2.3.2含片硬度、崩解时间的测定采用游标卡尺测定TBT的厚度和直径，片剂测试仪测量片剂的硬度。崩解时间的测定选取12名健康志愿者（20～30岁，来自成都中医药大学）评价。将片剂含于口腔内，直到片剂崩解完全，记录时间，得到其体内崩解时间；将900 mL水加热维持在（37.0±0.5） ℃，作为崩解介质，采用崩解仪测定含片的体外崩解时间。 TBT的基本制剂质量参数见表1。掩味后2种含片的外观直径略大于原片，厚度变小，可能是由于硬度变小所导致。4种含片的体内崩解时间与体外崩解时间差异较大，可能是由于人体测试过程中会不自主的摩擦搅拌含片，故崩解时间缩短。4种TBT的体外崩解时间均能满足口含片不在10 min内全部崩解或溶化的要求。
2.3.3涩味掩蔽效果评价
（1）电子舌评价：采用前期建立的电子舌涩味 评价方法，以鞣酸为涩味标准物质，利用电子舌建立涩味评价模型，用鞣酸浓度表征 4种含片的涩度[12]。
（2）感官分析验证：采用视觉模拟量表法（visual analogue scale，VAS）进行评估。感官评价小组由来自成都中医药大学的健康志愿者（20～26岁，味觉正常，无抽烟、酗酒史）构成，实验经过成都中医药大学附属医院伦理委员会（批准编号：2014KL016）审核批准。首先，采用酸（柠檬酸）、苦（奎宁）、甜（蔗糖）、咸（氯化钠）、鲜（谷氨酸钠）、涩（鞣酸）6种味觉溶液测试志愿者的味觉灵敏度；再用鞣酸溶液（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL）训练志愿者对涩味强度的认知，熟悉评价标准。最终，15名志愿者（5名男性和10名女性）参加TBT的涩味评估。志愿者将口含片置于口腔内，含服至无颗粒感，根据量表的标尺评分。样品测试间隔，用纯水冲洗口腔至无涩味感，并给予一定时间休息。
（3）涩味掩蔽效果评价：不同处方TBT的涩味评价结果见图5。电子舌量化结果（图5-A、B）显示，pH调控后的掩味片（TBT3和TBT4）的涩度明显弱于调节前（TBT1和TBT2）。TBT1为原TBT，其涩度相当于5.92 mg/mL鞣酸的涩味；TBT2由原处方去掉柠檬酸制得，其涩度相当于2.89 mg/mL鞣酸；TBT3由掩味提取物制得，其涩味相当于0.54 mg/mL鞣酸；TBT4由掩味提取物以及去除柠檬酸处方制得，其涩度相当于0.50 mg/mL鞣酸。该结果与志愿者VAS评分结果（图5-C）较为一致。电子舌与感官评价结果均表明，三果汤掩味含片（TBT3、TBT4）的涩味显著弱于pH调节前（TBT1、TBT2）。
柠檬酸对2种pH值三果汤提取物成型后片剂的涩味影响不同，可能是因为加入辅料后片剂的pH环境会有小幅升高。TBT2为原提取物不加柠檬酸制备，故pH略高于3.5，涩味弱于TBT1（原提取物加柠檬酸）。TBT4为掩味提取物不加柠檬酸制备，故pH略高于4.5，涩味强于TBT3（掩味提取物加柠檬酸）。最终以涩度值最低的TBT3制备工艺作为TBT的涩味掩蔽方法，即仅调节三果汤提取物pH值，其他工艺与原处方相同。
2.3.4 溶出度测定
（1）供试品溶液的制备：采用浆法测定4种TBT的溶出度，以没食子酸含量计。取900 mL经超声脱气处理的蒸馏水（37.0±0.5） ℃于溶出杯，设定转速 50 r/min。分别于5、10、15、20、40、60 min取样，0.22 µm微孔滤膜滤过。精密称量4种TBT，加入25 mL甲醇，超声提取30 min，0.22 µm微孔滤膜滤过，用于含量测定。
（2）对照品溶液的制备：精密称取没食子酸对照品，加甲醇溶解，0.22 µm微孔滤膜滤过。
（3）色谱条件：色谱柱为Welchrom C 18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%磷酸水溶液-甲醇；梯度洗脱程序为0～6 min，5%甲醇；6～15 min，5%～7%甲醇；15～20 min，7%～15%甲醇；20～25 min，15%～21%甲醇；25～31 min，21%～22%甲醇；31～41 min，22%甲醇；41～45 min，22%～32%甲醇；45～60 min，32%～65%甲醇；60～65 min，65%～5%甲醇；检测波长为270 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL。
（4）溶出度测定结果：以峰面积计算各时间点的累积溶出率，溶出曲线见图6。图6-A为4种含片的含量测定色谱图。以TBT1为参照，TBT2、TBT3、TBT4成分与其相似度分别为0.997、0.991、0.989。TBT质量标准以没食子酸计，图6-B显示TBT2中的没食子酸溶出度显著低于其他3种含片，TBT1、TBT3、TBT4则基本相同。掩味含片TBT3的成分与原片仅有略微差异，质控成分没食子酸的溶出度与原片在60 min基本相同。
2.3.5体外生物活性评价
（1）抗氧化活性：采用DPPH自由基清除能力测定TBT的抗氧化活性[13]。制备0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 mg/mL TBT样品。采用紫外-可见分光光度计在517 nm处测定空白溶剂和样品溶液吸光度。将清除率与供试品中提取物浓度作图，建立两者函数方程，得到半抑制浓度（IC 50）。
（2）抑菌活性：采用纸片扩散法测定TBT对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制活性[14]。将菌种接种至固体培养基，置于培养箱37 ℃培养24 h。单一菌落接种至50 mL液体培养基，置于摇床37 ℃培养。调节菌落数至5×10 7CFU/mL （金黄色葡萄球菌）、1×10 7CFU/mL （白色念珠菌）。在固体培养基分别加入上述菌液各200 mL，涂抹均匀。各取1片TBT，分别溶解于20 mL人工唾液。将纸片置于培养基，加入5 mL样品溶液，37 ℃孵育24 h。测定抑菌圈的直径，平行6份。
（3）体外生物活性评价：4种TBT的抗氧化活性与抑菌活性见图7。4个处方的DPPH清除自由基活性IC 50分别为0.143、0.143、0.147、0.152 mg/mL。掩味含片的抗氧化活性略低于原片。抑菌结果显示，4种含片均具有抑菌活性，其中TBT3对金黄色葡萄球菌抑制活性较好，TBT1对白色念珠菌抑制活性较好。综上，pH值调节三果汤涩味对含片抗氧化活性与抑菌活性仅有轻微影响。
2.4数据处理
运用SPSS 22.0软件对数据统计分析，以表示。组间采用单因素方差分析，方差齐者组间进行LSD检验，方差不齐者进行Tamhane检验。曲线拟合采用Origin 9.0软件，主成分分析（principal component analysis，PCA）采用SIMCA-P 13.0软件。
3讨论
目前，最常用的涩味掩蔽手段有去除多酚[18]、物理包覆[19]、添加矫味剂等。三果汤富含的没食子酸、鞣花酸等多酚是“清热利咽”的重要物质基础。环糊精包合等物理包覆掩味方法对于口含片这种特殊剂型并不适宜。口含片在口腔停留时间长，过程中还伴随摩擦、咀嚼，极有可能破坏包覆的物理结构，导致多酚释放。药品生产上主要通过增大矫味剂用量改善口感，效果有限且会对糖尿病等患者用药造成影响。基于TBT的特殊剂型与“清热利咽”的药效物质基础，以上常规方法难以达到理想的掩蔽效果。
本实验从多酚-唾液蛋白相互作用的涩味产生机制出发，通过pH值影响三果汤与唾液蛋白相互作用，调控TBT涩味强度。三果汤在pH 4.5与唾液蛋白的结合作用最弱，涩味掩蔽效果明显，基本不影响抗氧化活性和抑菌活性。TBT涩味的成功掩蔽表明，通过pH调控多酚药物涩味的模式科学可行。此外，与其它掩味手段相比，该方法实用便捷，无需复杂仪器，只需在制剂环节中稍作简单的改变。同时，涩味不仅广泛存在于药物，还集中在葡萄酒、茶、果汁等食品上。因此，该掩蔽模式不仅能在药物中应用，还可指导食品涩味的掩盖。
本研究发现三果汤多酚与β-酪蛋白结合具有pH依赖性，在宏观层面证明了通过pH调节多酚-唾液蛋白相互作用来掩蔽三果汤涩味方法的有效性。药物pH改变，多酚组成和状态会随之改变。pH降低使多酚转变为未解离状态，通过氢键增加对唾液蛋白的亲和力[20]。同时，多酚还能改变蛋白的构象，不同类型多酚改变情况不同[15]。蛋白质作为一种两性电解质，pH是决定其结构的重要因素。pH变化会破坏在多肽链中形成盐桥的带电残基之间的静电相互作用，改变蛋白质折叠结构，影响与多酚的结合[21]。具体影响取决于蛋白质的等电点、分子电荷和构象等。因此，推测pH值主要通过影响多酚成分和唾液蛋白结构来调控涩味，下一步将从以上角度对pH掩蔽TBT涩味的机制开展研究。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：郑 玉，谢兴亮，刘 俊，韩 丽，林俊芝，樊三虎，莫太刚，张定堃，韩 雪．基于pH调控多酚-唾液蛋白结合作用的三果汤含片涩味掩蔽方法研究 [J]. 中草药, 2022, 53(13): 3953-3961 .返回搜狐，查看更多
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