杆状病毒表达系统简介
▋ 杆状病毒
杆状病毒（Baculovirus）是一类基因组大小约为80-180 kb的双链环状闭合DNA病毒，属于杆状病毒科（Baculoviridae），有核型多角体（Nucleopolyhedovirus）和颗粒体（Granulovirus）两个病毒属。病毒粒子的形态一般为棍棒状，长度为200-400 nm，宽度为40-110 nm，因病毒核衣壳形似杆状而得名。目前已分离得到600多种杆状病毒，对节肢类动物具有致病性，主要感染膜翅目、双翅目和鳞翅目昆虫。
杆状病毒在感染周期产生两种病毒粒子：一种为包埋型病毒粒子（Occlusion-derived virions，ODV），适应于恶劣环境下在虫体之间感染繁殖；另一种为出芽型病毒粒子（Budded virions，BV），能够在虫体内细胞之间进行扩散，也是体外条件下产生重组蛋白的主要病毒粒子类型（见图1）。
图1 包埋型（ODV）和出芽型（BV）病毒粒子形态
在实验室研究与生物制品生产中，最常用的是苜蓿环纹夜蛾中分离出的苜蓿尺蠖核型多角体病毒（Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV），其基因组大小约为130 kb，含154个开放阅读框。AcNPV的多角体蛋白基因Polh（polyhedrin，Polh）和参与多角体膜形成的基因p10带有强启动子，且其编码的蛋白为病毒扩增的非必要组分，可插入外源片段，故用于表达目的蛋白。
▋ 昆虫细胞
杆状病毒的宿主细胞为昆虫细胞，应用较广的昆虫细胞系主要有2种：草地夜蛾细胞系（Spodopteraugerda cell line，Sf），常用Sf21及其分离株Sf9细胞；粉纹夜蛾细胞系（Trichoplusia ni cell line，Tn），常用商品化的High Five™（Hi5）细胞。Sf9细胞更适合于重组病毒扩增及包装，Sf21因细胞直径大更适用于病毒滴度空斑实验观察，而Hi5细胞更适用于分泌蛋白表达。这些昆虫细胞对AcNPV极度敏感，在大规模反应器中可高密度悬浮培养。
▋ 杆状病毒表达系统
杆状病毒表达系统（Baculovirus expression system，BVES）是以杆状病毒作为外源基因载体，以昆虫细胞作为宿主进行外源蛋白生产的真核表达系统。早期的BVES采用同源重组技术得到重组病毒，即将外源基因克隆至AcNPV非必需核型多角体基因的强启动子下游，并与野生型AcNPV DNA共转染昆虫细胞，经同源重组和病毒空斑纯化得到产物。但这种方法重组率较低（0.1%~1.0%），并且需要经过多轮空斑纯化才能得到重组病毒，很大程度上限制了BVES的应用。
近年来，新型生物制品行业不断发展，多种BVES（包括Bac-to-bac、MultiBac等）的应用极大地优化了重组病毒构建和筛选的过程。
图2 Bac-to-Bac系统产生重组杆状病毒和基因表达
优势
生物制品领域BVES的应用
BVES具有易于规模化生产、培养成本低、宿主残留对脊椎动物的生物安全性高等优势，已陆续被研究用于生产重组蛋白、rAAV载体、亚单位疫苗、VLP等。
1983年，首次使用BEVS-Sf9系统成功表达出人β-干扰素，该方法被证明是一种经济可行的重组蛋白生产平台。
2002年，Urabe等通过携带AAV包装基因的重组杆状病毒感染Sf9细胞生产rAAV，产量远高于HEK293表达系统，可达 10¹⁴VG (vector genomes)/L，满足临床rAAV载体用量，为rAAV载体的生产提供了一种简单快捷、经济高效的方法。
2013年，全球第一支针对流感病毒的三价重组亚单位疫苗（Recombination HA vaccine，rHA vaccine）FluBlok®批准上市，用以预防流感病毒的大面积爆发，该疫苗即以B VES-Sf9作为表达系统。2016年，FDA又通过了覆盖率更高的FluBlok®四价流感疫苗。
在新型冠状病毒大流行的背景下，2020年11月英国布里斯托尔大学生物化学学院Christiane Schaffitzel于Science发文表明游离脂肪酸或可干预新型冠状病毒COVID-19，并用杆状病毒感染的Hi5昆虫细胞生成了SARS-CoV-2糖蛋白。
截至2021年7月，全球共有32个蛋白亚单元疫苗正在开展临床试验研究；截至2022年09月22日，查找到14个新冠重组疫苗（Sf9细胞）和1个Hi5相关药物提交了临床试验登记。
杆状病毒表达宿主残留核酸风险控制
目前关于宿主细胞残留DNA（ rDNA）的风险研究，主要包括传染性、致癌性、免疫原性等，各国药典对其残留量有着严格的限度要求：美国食品药品监督管理局（FDA）发布的指导原则中指出生物制品宿主细胞DNA残留限度不得超过100 pg/剂，对于大剂量的生物制品（如单克隆抗体），根据其残留DNA来源及给药途径，DNA残留量可放宽至10 ng/剂。《欧洲药典》（EP10.0）通则规定的生物制品残留DNA限度大多为不超过10 ng/剂。2020年版《中国药典》三部规定，以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不能超过100 pg/剂。
在生物制品领域杆状病毒表达应用逐步提升的大背景下，亟需建立合适的检测方法监测生产工艺，控制Sf9细胞、Hi5细胞等宿主昆虫细胞残留核酸限度，以确保产品的安全性和质量。
湖州申科提供Sf9&AcNPV残留DNA检测试剂盒（多重PCR-荧光探针法）和Hi5&AcNPV残留DNA检测试剂盒（多重PCR-荧光探针法），用于定量检测BVES来源的生物制品中残留昆虫细胞（Sf9/Hi5）DNA和杆状病毒（AcNPV）DNA，助力生物制品制造。
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