近期，国际学术期刊《Nucleic Acids Research》在线发表了中国科学院武汉病毒研究所/生物安全大科学研究中心曹晟研究员课题组完成的最新成果，论文题目为“Structural transitions during the cooperative assembly of baculovirus single-stranded DNA-binding protein on ssDNA”。该研究解析了杆状病毒单链核酸结合蛋白HaLEF-3在未结合ssDNA和结合ssDNA两种状态下的不同构象，揭示了HaLEF-3在结合ssDNA时的独特组装方式。
单链DNA结合蛋白（SSB）在DNA复制、修复和重组中发挥重要作用。SSB可以与ssDNA发生结合，同时由于相邻SSB亚基的相互作用，使得SSB与ssDNA的结合过程表现为不同程度的协同性。为研究相邻SSB参与协同作用的分子机制，就必须得到高分辨率的SSB-ssDNA复合物结构模型，但是由于SSB-ssDNA所形成的丝状复合物往往具有高度的柔性，相关研究一直比较困难。
该研究首先解析了无ssDNA存在时HaLEF3的晶体结构，分辨率为3.5埃。此时，HaLEF-3是以同源八聚体的形式存在，每四个单体首尾相接形成一个C4对称环，两个环面面相对以C2对称进行堆叠，沿着C2轴处有一狭窄的通道与八聚体的中心孔相连。一些带正电荷的氨基酸残基（K164, K271, R268和 K360）沿C2孔道分布，其中大部分是ssDNA结合的关键位点。
研究人员摸索条件获得了HaLEF-3结合ssDNA的稳定复合物，并利用武汉病毒研究所300千伏冷冻电子显微镜（日本电子CRYO ARM300）解析了HaLEF-3与dA 140 复合体结构，螺旋重构整体分辨率为3.5埃，局部优化后分辨率为3.1埃。在HaLEF-3-dA 140复合体模型中，HaLEF-3分子的DII结构域连续定向地与ssDNA结合，DI结构域不直接参与ssDNA的相互作用。DII结构域中的K164, R268, K271, R294, R313和K360共同形成一个正电荷沟槽结合ssDNA，每个HaLEF-3分子与6个核苷酸发生相互作用。通过比较未结合ssDNA状态和结合ssDNA状态下的两种蛋白质构象，发现HaLEF-3从环状转变为螺旋排列主要是由位于DI结构域与DII结构域之间的柔性铰链区变构所导致。DI结构域与相邻分子DII结构域作用相对稳定，其作用界面为协同作用提供主要贡献。基于结构分析，对可能会影响ssDNA结合的关键位点进行了突变，并通过EMSA实验，发现K164、E184、R268、K271、Y311参与了HaLEF3结合ssDNA的过程。此外，该研究还提出了HaLEF-3-ssDNA螺旋体组装的局部协同结合模型。这些研究表明HaLEF-3有可能代表一类新的SSB家族。
图：HaLEF-3与ssDNA的结合。（A）HaLEF-3的晶体结构；（B）HaLEF-3-dA 140复合体的冷冻电镜结构；（C）ssDNA结合关键位点的EMSA分析。
（来源：病毒学界）返回搜狐，查看更多
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