新疆阿魏Ferula sinkiangensisK. M. Shen是伞形科阿魏属植物的干燥树脂，是《中华人民共和国药典》2020年版收录阿魏的基原植物之一，具有强烈的葱蒜样臭味，具有消积、杀虫、化癥和散痞等功效，主治肉食积滞、瘀血癥瘕、腹中痞块、虫积腹痛等疾病，性苦、辛，温，归脾、胃经，具有很好的药用价值 ［ 1-2］。新疆阿魏主要含有黄酮类、多糖类、苯丙素类和挥发性成分，不同部位分离物具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、调节血脂和提高免疫功能等功效 ［ 3-4］。据研究显示新疆阿魏具有预防肿瘤的作用，在多种癌症（如结肠癌、胃癌、肺癌和宫颈癌等）中均表现出较好的抗肿瘤作用 ［ 5-8］。目前，由于中药的物质基础比较复杂，对于传统的药理研究方法很难进行全面深入的研究探讨，而网络药理学能通过建立“靶点-药物-疾病”整个生物体网络，整体系统地将药物和疾病连接起来 ［ 9-12］。本研究主要探讨新疆阿魏中的化学物质、抗癌的作用机制及可能作用的靶点，通过网络药理学研究帮助筛选新疆阿魏的药效物质基础，对进一步研究其抗肿瘤作用单体成分及作用靶点提供理论基础。
1方法
1.1新疆阿魏有效成分及靶点的筛选
利用草药-中医证候-西医症状-成分-靶标-疾病关联网络数据库（SymMap：http：//www.symmap.org/）收集新疆阿魏的化学成分以及靶点。在SymMap数据库检索“阿魏”，可以发现阿魏的成分信息、靶点信息，以及在PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中查询活性成分的SMILES格式，并利用Swiss Target Prediction （http：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库进行靶点预测，将2个数据库得到的靶点信息合并去重，得到新疆阿魏活性成分的相关靶点，并绘制成分-靶点网络图。
1.2癌症靶点的筛选
在Genecards数据库（https：//www.genecards.org/）中，以“cancer”为关键词检索相关的靶点，并以靶点-疾病相关度≥10进行相关筛选，得到癌症相关疾病靶点。
1.3蛋白质相互作用（PPI）网络绘制及核心靶点的筛选
利用Venny作图软件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）寻找新疆阿魏与癌症的交集靶点，得到交集靶点，再将交集靶点导入STRING（https：//cn.string-db.org/）蛋白质互相作用数据库，设置生物种类为“Homo sapiens”、设定置信度为“＞0.4”，删除游离节点，同时保存为TSV格式文件，再将其导入Cytoscape 3.9.0软件得到PPI网络图，连线越密集，说明作用越大，进而进行拓扑分析，选定度值（degree）、接近中心性（closeness centrality，CC）和中介中心性（betweenness centrality，BC）作为筛选条件，通过筛选得到关键靶点，以上值越高表明靶标越重要。
1.4基因本体（GO）功能富集及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析
为了挖掘新疆阿魏对癌症的干预机制，将交集靶点导入DAVID（http：//david.ncifcrf.gov/）数据库，设置物种为“Homo sapiens”，获取靶点-通路信息，使用微生信在线网站（https：//www.bioinformatics.com.cn/）对交集靶点进行GO功能（-lg P 前10位）与KEGG通路（Count值前20位）富集分析（P＜0.05），并对新疆阿魏主要抗癌通路进行分析。
1.5“成分-靶点-疾病”网络构建
将最终得到的交集靶点、活性成分、KEGG通路导入Cytoscape 3.9.0软件（http：//cytoscape.org/），构建“活性成分-靶点-通路”网络图，其中节点表示活性成分、靶点以及通路，线边表示他们之间的关系。
1.6分子对接验证
从PubChem数据库中下载筛选的主要活性成分的结构，在PDB数据库下载CCND1、JUN、CXCL8和PIK3CA靶点的PDB结构。利用AutoDock软件对蛋白质进行去水、加氢等操作，将小分子配体与蛋白质受体转化为PDBQT格式并确定对接口袋位置，进行对接得到结合能。
2结果
2.1筛选得到的新疆阿魏有效成分及靶点
根据SymMap及SwissTargetPrediction数据库查找，收集到新疆阿魏的化学成分34个，具体信息见表1，根据SymMap及SwissTargetPrediction数据库查找，对应靶点537个。除6- O - E - 阿魏酰基筋骨草醇、21- O - 甲基川楝子五醇、assafoetidnol A、assafoetidnol B、巴德拉阿魏素、古蓬阿魏酸、neveskone、多花素宁、十一烷基磺酰乙酸这9个化学成分与靶点关联较弱以外，其余25个化学成分如阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、柠檬烯和β-蒎烯等成分与537个靶点关联密切。
2.2筛选得到的癌症靶点
在Genecards数据库中检索出癌症相关的靶点26 646个，通过靶点-疾病相关度≥10这个条件对其进行筛选，得到癌症相关疾病靶点1 155个。
2.3新疆阿魏成分靶点及癌症靶点交集靶点的确定
通过韦恩图得到新疆阿魏与癌症的交集靶点134个，如图1，包括AR、CYP19A1、ESR1、TOP1、ESR2、PTGS1、GLI1、PPARG、CTSD、TERT、CYP17A1、SRD5A2、NR3C1、PGR、SHBG、ALOX5、VDR、RARB等。表明新疆阿魏靶点中有134个与癌症靶点相同，这些新疆阿魏成分可能作用于这些靶点发挥抗癌作用。
2.4构建的PPI网络
将交集靶点输入STRING数据库中，数据库中获得新疆阿魏活性成分与癌症共有靶标的相互关系，将所得结果导入Cytoscape 3.9.0软件，绘制PPI网络，见图2。PPI网络中包含134个节点和2 413条线，线代表蛋白质之间的相互作用关系，节点的大小与度值大小呈正相关，同时表示在此体系中的贡献度越大，根据度值＞2、CC＞0.005和BC＞0.003提取核心靶点构建网络，通过拓扑分析得到27个关键靶点，见表2，按照度值排序，排名前10的靶点分别为连环蛋白β1（CTNNB1）、表皮生长因子受体（EGFR）、雌激素受体1（ESR1）、白蛋白（ALB）、细胞周期蛋白D1（CCND1）、信号转录激活因子3（STAT3）、热休克蛋白（HSP）、SRC原癌基因（SRC）、JUN原癌基因（JUN）、雷帕霉素激酶（mTOR）靶点。
2.5 GO富集分析以及KEGG通路结果
根据DAVID数据库对新疆阿魏抗癌的交集靶点进行GO富集分析，获取GO数据331条（P＜0.05），其中生物过程（BP）249条，细胞组成（CC）31条，分子功能（MF）51条，使用微生信网站绘制GO分析条形图，根据显著性P值（P＜0.05）取前10位按从大到小排列，具体见图3，分析结果表明，BP主要包括RNA聚合酶II启动子转录的正向调控、基因表达的正向调控、转录的正向调控、DNA-模板信号转导等；CC主要包括细胞质、细胞核、核浆等方面；MF主要包括蛋白质结合、相同的蛋白质结合、酶结合、转录因子结合等。
通过DAVID数据库搜寻交集靶点的KEGG通路，发现其共有133条，并结合微生信网站绘制气泡图（图4），分析KEGG富集通路（P＜0.05）主要有：PDL-1表达和PD-1免疫检查点通路、IL-17信号通路、雌激素信号通路和PI3K-Akt信号通路等。
2.6化合物-靶点-通路网络分析
采用Cytoscape 3.9.0软件建立“化学成分-靶点-作用通路”网络图，共有194个节点（其中化学成分节点34个、靶点节点27个、通路节点133个），从化合物角度，新疆阿魏中阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、柠檬烯和β-蒎烯等化学物质起主要作用；从靶点角度，分析发现细胞周期蛋白-D1（CCND1）、JUN原癌基因（JUN）、C-X-C基序趋化因子配体8（CXCL8）和人磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚单位α异构体（PIK3CA）等靶点作用于癌症的通路比较多；从通路角度，作用较强的通路为PDL-1表达和PD-1免疫检查点通路、IL-17信号通路、雌激素信号通路和PI3K-Akt信号通路等，化学成分-靶点-作用通路网络（图5）则系统整体地表明了新疆阿魏通过多种成分、多种靶点和多种通路发挥抗癌作用。
2.7分子对接验证结果
为了验证“化合物-靶点-作用通路”网络分析的主要活性成分与癌症相关靶点的结合能力，通过分子对接分析进行预测。结果表明，活性物质阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、柠檬烯和β-蒎烯与关键靶点CCND1、JUN、CXCL8、PIK3CA均具有较好的结合能力。尤其，法尼斯淝醇A和法尼斯淝醇C与各靶点之间的结合能均低于-29.3 kJ·mol-1，结合活性较优，构象稳定（表3）。如法尼斯淝醇C与多个不同氨基酸残基通过常规氢键、碳氢键等相互作用于CCND1靶点蛋白。部分成分与靶点分子对接示意图见图6。
3讨论
新疆阿魏中主要成分为阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、柠檬烯和β-蒎烯等，其中阿魏酸被大量研究证明具有调控JAK2/STAT6免疫信号通路抑制肺癌细胞增殖和转移和抑制癌症的作用 ［ 13-15］。法尼斯淝醇A和法尼斯淝醇C有很好的抗癌作用，具体体现在抑制癌细胞扩散面积，抑制耐药肿瘤细胞胞内蛋白质（P-gp）的运输功能等方面 ［ 16-17］。柠檬烯具有化学预防作用、抑制细胞周期与诱导细胞凋亡以及抑制肿瘤转移与侵袭等作用 ［ 18］。β-蒎烯对人源SW872脂肪肉瘤细胞具有抑制作用 ［ 19］。
对关键靶点进行分析得到CCND1、JUN、CXCL8和PIK3CA与癌症的发生关联密切，CCND1蛋白表达情况与肉瘤部位、TNM分期、病理类型、局部复发和远处转移情况相关，沉默抑制了的细胞周期、增殖、侵袭和迁移，可能作为结肠癌的新治疗靶点 ［ 20-21］。肿瘤细胞的侵袭性生长需要降解细胞外基质、血管生成和细胞迁徙，JUN和Fos蛋白组成的AP-1因子可以调节参与这些生物学行为的基因的表达，与肿瘤细胞的侵袭性生长、肿瘤血管生成以及肿瘤转移关联紧密 ［ 22］。CXCL8是一种在结直肠癌肿瘤微环境中升高的炎性趋化因子。在癌症环境中，CXCL8在中性粒细胞趋化性、促进血管生成、侵袭和转移中发挥重要作用，在驱动不利的肿瘤组织学特征和促进转移中起作用 ［ 23-25］。在对乳腺癌的研究中，发现循环肿瘤细胞DNA（ctDNA）中存在PIK3CA突变，这与肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）水平较低有关，并倾向于预测不良结果 ［ 26］。
通过KEGG分析，新疆阿魏主要作用于PDL-1表达和PD-1免疫检查点通路、IL-17信号通路、雌激素信号通路和PI3K-Akt信号通路等通路进行抗癌。说明新疆阿魏的抗癌机制是通过作用于相关的靶点，对通路进行协同作用来完成的。
通过本研究明确了新疆阿魏治疗癌症的作用靶点和潜在的作用途径，帮助筛选了新疆阿魏的药效物质基础，对进一步研究其抗肿瘤作用单体成分提供参考，为后续深入研究新疆阿魏抗癌的作用和机制提供基础依据。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：张敏，李莎妮，喻楷权，吴济丽，陈宇琪，杨建波，蔡伟．基于网络药理学与分子对接技术新疆阿魏抗癌作用机制探讨 [J]. 药物评价研究, 2023, 46(4): 728-737 .返回搜狐，查看更多
责任编辑：