基于多变量数据分析的生物药制剂处方稳健性研究
来源
《 中国新药杂志》2023年第32卷第6期
作者
聂磊，方伟杰，郭婷婷，钱慈，章熠，瞿海斌，王海彬
浙江博锐生物制药有限公司
海正生物制药有限公司
摘要
目的：以抗体偶联小分子药物（ADC）HS630为例，探讨多变量数据分析（MVDA）在生物药制剂处方稳健性研究中的应用。
方法：采用5因子2水平的部分析因设计，考察蛋白质含量、3种辅料含量及pH值对关键质量属性的影响规律。各组制剂样品制备后分别置于高温条件下28d和光照条件下10d，进行多聚体含量和游离DM1含量检测和结果分析。
结果：采用偏最小二乘法（PLS）进行模型拟合和数据分析，模型拟合良好，预测性能尚可。处方中各辅料和pH的变异对多聚体含量和游离DM1含量均无显著影响。蛋白质含量和pH的升高会在一定限度上增加冻干制剂中游离DM1的含量，但影响并不显著。光照和高温对各处方均有显著影响，但影响趋势一致且整体变化幅度不大。本研究范围内制剂处方稳健。
关键词
多变量数据分析；生物药制剂；处方稳健性
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正文 |
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与化学小分子药物相比，生物药的分子量更大，结构和理化性质也更为复杂。以单克隆抗体为例，其分子量高达150kDa，且抗体序列中存在多个潜在的修饰位点，其在表达、纯化、储存及运输过程中，受到微环境的影响会发生降解、聚合或翻译后修饰，造成药品质量批间差异增大，甚至可能会影响药物的药动学特征、生物学活性和免疫原性等，引起临床的不良后果[1-5]。因此，针对生物药的特性，通过处方筛选和优化获得稳健的药物制剂处方，增强生物药存储和运输稳定性，是保障临床用药安全性和有效性的重要手段。
制剂中的辅料和活性成分通常通过批次生产获得，操作人员、环境、生产地点、供应商、生产工艺的变化都可能导致其特性的改变，因此即使每批次辅料和活性成分均符合质量标准，仍然不可避免地存在一定的批间差异[6]。制剂处方的稳健性研究就是研究制剂中辅料的变化和活性成分的变化对药物关键质量属性的影响[7]。随着监管部门和制药企业对质量源于设计（quality by design，QbD）的理解和接受，越来越多的企业应用QbD理念进行制剂处方的筛选和稳健性研究。Awotwe⁃Otoo等[8]采用QbD方法评估了单克隆抗体冻干制剂处方组分及其相互作用对关键质量属性的影响，并确定了最佳的辅料浓度和pH值，获得了制剂处方的设计空间。Martin⁃Moe等[9]系统地提出了基于QbD理念的生物药制剂工艺开发方法。Wurth等[10]首次阐述了基于QbD理念的单克隆抗体药物制剂处方稳健性研究方法，并结合长期稳定性质量标准对不同的模型拟合结果和处方稳健性判断标准进行了研究。
为了充分、快速地评估和理解各处方间的差异，在处方筛选和稳健性研究中通常采用多种实验条件（如高温、高湿、光照、冻融及振荡等）开展研究，并设置不同的处理时间进行关键质量属性检测。由此获得的数据通常是多维、复杂的，包含了处方、实验条件及时间等多个维度，这为数据分析带来了挑战。多变量数据分析（multivariate data analysis，MVDA）又称多变量分析或多元统计分析，是化学计量学的重要内容，其技术核心是将高维的数据空间投影到低维的主成分，使得数据分析问题得到极大简化。近些年，随着计算机科学和化学计量学的发展，MVDA技术在生物制药领域得到了广泛应用，如细胞培养基开发[11]、根本原因分析（root cause analysis，RCA）[12-13]、过程理解和优化[14-15]以及过程分析技术（process analysis technology，PAT）[16-18]等，但在制剂处方稳健性研究中鲜有报道。
本文以抗体偶联小分子药物（antibody drug con⁃jugates，ADC）HS630为例，探讨MVDA在制剂处方稳健性研究中的应用。HS630是罗氏公司已上市药物Kadcyla®（trastuzumab⁃MCC⁃DM1，T⁃DM1）的生物类似药，由浙江博锐生物制药有限公司开发，目前正在开展临床研究。
材料
1 仪器
Agilent1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司），色谱柱为TSKgel G3000SW XL （日本TOSOH公司，300mm×7.8mm，5μm）和Zorbax Eclipse XDB⁃C 18 （美国安捷伦公司，150mm×4.6mm，5μm）；Epslion⁃2⁃6D⁃LSC plus冻干机（德国Christ公司）；Labonce⁃120PS药品强光稳定性试验箱（北京兰贝石恒温技术有限公司）；KBF720恒温恒湿箱（德国Binder公司）。
2 试药与试剂
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方法与结果
1 实验设计
对HS630制剂处方中的关键组分进行稳健性研究，分析各制剂辅料和活性成分在实际生产过程中由于各种原因可能产生的差异及其对药物质量产生的影响。采用5因子2水平的部分析因设计（分辨率为Ⅲ，含8个实验设计和2个重复的中心点），考察蛋白质含量、3种辅料（蔗糖、琥珀酸和吐温20）含量及pH值对关键质量属性多聚体含量和游离DM1含量的影响规律。实验设计的因素水平和编码值见表1，因子水平的设置综合考虑了预期的质量标准、不同批次原辅料可能引起的差异、制剂配液过程中的偏差及分析方法的变异等。
按照表2实验设计完成样品配制后进行冻干，获得10组不同处方样品，其中处方9和10为目标制剂处方的实验重复。将前述样品溶解后进行多聚体含量和游离DM1含量测定，结果见表2。
为进一步考察不同处方的稳健性，采用高温（40℃）和光照条件（4500±500）Lx进行强制降解实验研究，并分别于光照d10，高温d14和高温d28取样进行多聚体含量和游离DM1含量测定，实验条件和检测结果见表3。
2 样品的制备及稳健性研究
按照实验设计表进行HS630溶液配制，并经无菌过滤后，手动分装至2mL西林瓶中，每瓶装量体积为1mL。样品经冷冻干燥获得制剂样品。各实验设计组每组随机取3支制剂样品进行多聚体含量和游离DM1含量检测，计算平均值作为零时检测结果；每组随机取样3支制剂样品置于药品强光稳定性实验箱[（5±3）℃，光强为（4500±500）Lx]中，10d后进行多聚体含量和游离DM1含量检测；另取6支制剂样品置于（40±2）℃恒温恒湿箱中，分别于d14和d28进行多聚体含量和游离DM1含量检测，各实验检测结果见表3。
3 多聚体含量测定
将HS630样品溶于1mL超纯水，取适量溶液用超纯水稀释至5mg·mL -1 。采用TSKgel G3000SW XL （300mm×7.8mm，5μm）色谱柱进行多聚体含量测定；流动相为0.2mol·L -1 磷酸钾缓冲液，0.25mol·L -1 氯化钾和15%异丙醇；流速0.5mL·min -1 ，等梯度运行30min；检测波长280nm，柱温25℃。按照面积归一化法计算多聚体含量。
4 游离DM1含量测定
将HS630样品溶于1mL超纯水，取400μL加色谱乙醇800μL，混匀后置于2℃~8℃静置20min，12000r·min -1 离心20min，取上清液进行游离DM1含量检测。采用Agilent Zorbax Eclipse XDB⁃C18（150mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为0.08%乙腈溶液，梯度洗脱：0~40min，A70%~15%；40~41min，A15%~0%；41~44min，A0%；44~45min，A0%~70%；45~50min，A70%；流速1mL·min -1 ；检测波长252nm，柱温35℃。
5 数据分析
5.1 模型拟合
在制剂处方的稳健性研究中，对于不同的实验条件（如高温、光照、振荡、冻融等）和不同的处理时间，传统的方法是根据实验设计对不同条件和不同时间分别进行模型拟合和分析，评估关键工艺参数对关键质量属性的影响。该方法费时、繁琐，且无法系统评估不同实验条件和处理时间对关键质量属性的影响。
本研究将蛋白质含量、各辅料的含量及强制降解实验条件（高温和光照）设置为实验因子X，以多聚体含量和游离DM1为Y，采用偏最小二乘法（PLS）进行模型拟合和数据分析。采用SIMCA⁃P（version14.1，瑞典Umetrics公司）进行数据预处理和PLS回归模型拟合，通过交叉验证得到模型的最佳主成分数为3，建立的PLS模型结果如图1所示。R 2 Y（cum）是模型的累积回归决定系数，代表在Y轴方向随着主成分增加模型的累积解释率；Q 2 （cum）是模型的累积预测率，代表了模型的预测能力。
理论上R 2 ，Q 2 数值越接近1说明模型拟合的准确性越好，通常情况下，R 2 >0.8认为模型拟合较好，Q 2 >0.5认为模型具有较好的预测能力，且两者差值不应过大。结果表明，本研究的R 2 Y（cum）和Q 2 （cum）分别为0.82和0.64，表明模型拟合良好，且预测性能尚可。回归模型能够较好地解释Y，第1个主成分解释了48.3%的变异，第2个主成分解释了28.7%的变异。
5. 2 制剂处方稳健性分析
在PLS模型中，每个观测值在对应主成分方向上的投影称为得分，根据主成分得分绘制的图为主成分得分图（principal component score）。主成分得分是多变量数据分析结果中的一个重要参数，可以直观看出不同观测值之间距离，据此判别观测值的相似性或差异性。观测值之间距离越靠近，其相似性越高；反之，如果观测值之间距离越远，其差异性越大。与之相对应，原始变量的相似性或差异性可以用主成分荷载图（principle component loadings plot）展示。主成分载荷表征了主成分模型（线、平面或超平面）中每个原始变量（X和Y）的贡献程度。在得分图和载荷图上，距离原点近的观测值或变量对模型贡献较小、距离远的贡献大[19]。此外，载荷图与得分图是互相补充说明的，得分图上给定方向上的观测值的位置受到载荷图上同样方向上的变量影响。
本研究PLS模型前2个主成分得分图如图2所示，图中每个点代表一个实验条件，数字编号为表2和表3中的实验号。蓝色为高温0时结果，绿色和红色为高温14和28d结果。t[1]表示第1个主成分，t[2]表示第2个主成分。前2个主成分的载荷图如图3所示，图中每一个点代表一个原始变量，绿色为X变量，蓝色为Y变量。w∗c[1]表示第1个主成分，w∗c[2]表示第2个主成分。
得分图显示冻干后制剂零时样品呈长条状均匀分布，其中5号和8号处方单独分布在第三象限，呈现一定的偏离趋势。结合载荷图中蛋白质含量和pH值分布在第三象限并远离中心点，提示这两组处方的偏离与蛋白质含量和pH值有关，经确认5号和8号处方均为高蛋白浓度且高pH值处方；载荷图中Y变量多聚体含量和游离DM1含量均在两组制剂处方的偏离方向，提示这两组处方的多聚体含量和游离DM1含量有增高趋势。数据分析发现，5号和8号制剂处方的游离DM1含量明显高于其他制剂处方，但整体含量仍然低于2μg·mL -1 ，远低于质量标准，多聚体含量则整体偏差不大（见表2），提示高浓度和高pH条件下进行制剂冻干会导致游离DM1含量增加。在回归系数图中（见图4A），我们观察到蛋白质含量和pH值的误差线（回归系数的置信区间）均跨越零点，表明该回归系数与零无显著差异，提示蛋白质含量和pH值并不是导致游离DM1含量增加的显著独立因素，后续研究中需继续研究确认并考察2个因子之间的交互作用。
在得分图（图2）中，各处方经高温处理后整体沿第1个主成分的方向向右偏移，且时间越长偏移越多，表明高温对各处方的影响趋势一致，各处方在受到高温压力时表现出了相同的变化趋势。
结合载荷图（图3）发现，游离DM1含量落在横轴即第1个主成分上且远离中心点，表明高温对游离DM1含量有显著影响；在回归系数图（图4B）中，高温时间的误差线未跨越零点且绿柱在横轴以上，表明高温时间与游离DM1含量呈显著正相关性，即高温显著促进DM1的解离，高温时间越长各处方样品解离的DM1含量越高。从绝对数值来看，高温28d后游离DM1含量低于4μg·mL -1 ，约为零时的2倍左右，但仍远低于质量标准，风险可控。同样，高温对多聚体含量也有显著影响，且呈现正相关性，即高温时间越长各处方样品多聚体含量也越高，但是从绝对数值来看，多聚体含量整体变化不大，高温28d后最高增加至3.11%，远低于质量标准。
各处方经光照处理后，在得分图中整体沿横坐标向下偏移（图2），表明光照对各处方的影响趋势一致，各处方在受到光照后表现出了相同的变化趋势。由于光照后处方在得分图上沿着第2个主成分方向（纵轴方向）移动，垂直于游离DM1含量所在的第1主成分（图3），因此推测光照时间对游离DM1含量无显著影响，这在回归系数图（图4B）中光照时间的柱高和误差线上得到了证实。相反，光照时间对多聚体含量有显著影响，回归系数图（图4A）中光照时间的绿柱在横轴上方表明光照时间和多聚体含量呈显著正相关性，即光照会显著促进蛋白聚集，这主要与光诱导的不可逆共价交联有关[20]。从绝对数值来看，光照10d后多聚体含量由平均2.5%增加至平均2.8%，增加幅度很低且远低于质量标准，风险可控。
综上分析，处方中各辅料和pH在研究范围内的变异对关键质量属性多聚体含量和游离DM1含量均无显著影响。蛋白质含量和pH值的增高会一定限度上增加冻干制剂中游离DM1的含量，但影响并不显著。光照和高温对各处方均有显著影响，但影响趋势一致。高温会显著促进多聚体含量的增加和DM1的解离，光照会显著促进蛋白聚集，但整体变化幅度不大，远低于质量标准。因此，本研究范围内制剂处方稳健，生产及保存时应注意避光，且应在长期条件下继续研究温度对关键质量属性的影响趋势。
讨论
基于QbD理念的生物药制剂处方稳健性研究是早期工艺开发和临床晚期工艺表征中的重要环节，是保证上市后药物安全有效的重要手段[10]。尽管监管当局推荐采用QbD的方法进行制剂处方研究，但是与细胞培养和下游纯化相比，关于生物药制剂稳健性的研究较少，关注度较低。
制剂处方的稳健性研究应基于风险评估进行科学评价，并结合实际生产、储存、运输、临床用药等多种条件进行综合考虑[6]。本研究为制剂处方的稳健性研究提供了新的思路。
参考文献
详见《中国新药杂志》2023年第32卷第6期
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