转录因子研究套路（一）和（二）分别用具体的某一篇文献总结了转录因子的一般研究方法，转录因子研究套路（三）用多篇文献来举例并总结归纳了转录因子的研究方法。在今天的文章中，伯小远准备只讲一个转录因子基因——被誉为新的“绿色革命”基因——水稻理想株型基因（Ideal Plant Architecture1，IPA1）的研究进展，前后涉及十几年、多个课题组的重要研究进程，我们大家可以借此深度了解一个转录因子到底该如何研究。
本次推文的主要内容是：
发现
我国培育的许多超级稻品种都具备“理想株型”的特征，但其分子机制还不清楚。2010年，中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋团队和中国水稻研究所钱前团队在Nature Genetics杂志上发表了题为“Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice”的文章，首次发现OsSPL14的一个点突变干扰了OsmiR156对OsSPL14的调控，可产生分蘖数减少、抗倒伏、提高籽粒产量的“理想”水稻植株。
图1 对IPA1 QTL的图位克隆以及OsSPL14-GFP的亚细胞定位结果。作者利用籼稻TN1和能体现理想株型概念的粳稻SNJ（a）构建的遗传群体，精细定位出IPA1位点位于∽78kb的一段区间内，其包含12个候选基因（b-e）。和日本晴相比，在SNJ中经测序发现这12个基因中，OsSPL14的第3个外显子有1个碱基突变，导致一个氨基酸发生突变（f），在水稻根细胞的亚细胞定位实验显示IPA1定位于细胞核中（g）。
图2 OsSPL14ipa1的点突变对OsmiR156定向调控OsSPL14的影响。作者通过实验证明，SNJ材料中OsSPL14发生的点突变导致原本OsmiR156对OsSPL14转录本的正常切割被扰乱（b），进而导致SPL14蛋白含量升高（c）。
同一时间，日本名古屋大学的Motoyuki Ashikari和Hidemi Kitano团队与上述文章背靠背发表了题为“OsSPL14 promotes panicle branching and higher grain productivity in rice”的另一篇文章，得出了类似的结论，该文章表明OsSPL14在生殖期的高表达促进了水稻穗的分枝和粮食产量的提高，OsSPL14在营养期受到OsmiR156切割的影响，利用OsSPL14的等位基因可以提高水稻的产量。
图3 WFP QTL的鉴定和克隆。由于日本晴和ST-12在每穗谷粒数上的巨大差异，后者具有显著优势，因而选择日本晴和ST-12（a-d）作为亲本来构建遗传群体，精细定位出WFP位点位于∽66kb的一段区间内，其包含6个候选基因，再缩小至2.6kb的区域，最终找到了Os08g0509800（OsSPL14）在两种材料中存在序列差异（e）。备注：WFP是作者对其QTL位点的命名，是WEALTHY FARMER’S PANICLE的缩写。
寻找IPA1的下游基因
2013年，中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋团队在Plant Cell杂志上发表了题为“Genome-Wide Binding Analysis of the Transcription Activator IDEAL PLANT ARCHITECTURE1 Reveals a Complex Network Regulating Rice Plant Architecture”的文章，作者通过ChIP-seq鉴定了IPA1调控的下游基因，发现IPA1可直接与OsTB1（水稻分蘖的负调节因子）的启动子结合，抑制水稻分蘖。IPA1可正向调节DEP1（调控穗结构的重要基因）的表达，影响株高和穗长。
图4 通过双荧光素酶报告基因转录激活分析实验（A）、酵母转录激活实验（B）、EMSA（C）来验证IPA1是转录因子。关于转录因子，更多可参考文章“最强大脑炼成记——如何验证一个基因是转录因子”。
图5 通过ChIP-seq实验筛选IPA1的下游调控基因并鉴定其结合的顺式作用元件。关于ChIP-seq可参考文章“解析表观遗传学的工具——ChIP-seq（二）”。
图6 通过以上实验找到了TGGGCC/T顺式作用元件，但这个顺式作用元件和IPA1无法直接相互作用（图5C），根据之前的报道，作者认为IPA1可能通过与PCF1或PCF2相互作用才能靶向TGGGCC/T元件，后面用酵母双杂（A）、BiFC（B）先证实IPA1可以分别和PCF1、PCF2相互作用，再通过EMSA（在文章的补充材料中）、ChIP-qPCR（C、D）证明了IPA1是通过与PCF1或PCF2相互作用靶向TGGGCC/T元件的。
图7 通过之前的数据、RNA-seq的数据和文献检索，作者重点研究了IPA1和OsTB1、DEP1之间的关系。通过ChIP-qPCR（B）、EMSA（C）证实IPA1可与OsTB1启动子中的GTAC元件结合。再通过植株的表型及检测数据证明IPA1正向调节OsTB1的表达（D、E）。
图8 研究了IPA1和DEP1之间的关系。通过ChIP-qPCR（B）、EMSA（C）证实IPA1可与DEP1启动子中的GTAC元件结合。关于EMSA可参考文章“蛋白-核酸相互作用之EMSA实验正式上线啦。”
图9 通过植株的表型及检测数据证明IPA1正向调节DEP1的表达。
图10 IPA1的水稻株型调节模型。IPA1直接与GTAC元件结合以调节关键的植物株型调节因子，包括DEP1和OsTB1，而它通过与PCF1和PCF2的相互作用间接与TGGGCC/T元件结合以调节发育相关基因。
寻找与IPA1相互作用的蛋白（一）
2017年，中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋和王永红团队在Plant Cell杂志上发表了题为“Tissue-Specific Ubiquitination by IPA1 INTERACTING PROTEIN1 Modulates IPA1 Protein Levels to Regulate Plant Architecture in Rice”的文章，作者通过对IPA1的互作蛋白IPI1的鉴定，表明IPI1编码一个E3连接酶，能够和IPA1在细胞核内发生互作，并泛素化IPA1蛋白。
图11 鉴定出IPI1蛋白与IPA1相互作用。通过酵母双杂（A）、GST pull-down（B）、Co-IP（C）、BiFC（D）点对点验证IPI1与IPA1的相互作用。关于酵母双杂可参考文章“酵母杂交那些事儿（三）”。关于GST pull down可参考文章“蛋白互作研究方法之GST pull-down/GST pull-down MS技术”。关于Co-IP可参考文章“Co-IP—验证蛋白互作的不二之选"。
图12 体外泛素化分析确定IPI1的E3连接酶功能（A），体外泛素化分析确定IPA1是IPI1的底物（B），烟草瞬时转化实验（C）和水稻稳定转化实验（D）确定IPI1作为E3连接酶对IPA1的泛素化作用。更多可参考文章“蛋白翻译后修饰——泛素化”。
图13 体外实验（A）、体内实验-幼苗（B）测试MG132（一种26S蛋白酶体抑制剂）对IPA1降解的影响，体内实验测试IPI1对IPA1降解的影响（C），体内实验-烟草叶片测试MG132对IPA1降解的影响（D）。
图14 过表达IPI1对植株的影响，主要表现出更少的分蘖、更小的花序。
图15 在过表达IPI1的植株中检测茎尖、幼穗中的IPA1丰度。作者后面还做了IPI1的敲除植株以及相应的蛋白检测，检测茎尖、幼穗中的泛素化形式等实验（此处未显示）。
图16 由IPI1介导的IPA1翻译后的修饰模型。
寻找与IPA1相互作用的蛋白（二）
2017年，中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋团队在Cell research杂志上发表了题为“IPA1 functions as a downstream transcription factor repressed by D53 in strigolactone signaling in rice”的文章，作者发现IPA1是D53的直接下游成分。；另一方面IPA1可结合D53的启动子，并在独脚金内酯（SL）诱导的D53信号途径中作为重要的转录因子发挥作用。这些发现表明，IPA1与D53一起介导了水稻中SL调节的分蘖发育。
图17 通过基因编辑得到两种功能缺失突变体ipa1-10、ipa1-11，两种功能获得突变体ipa1-3D、ipa1-4D。通过向突变体外源施加SL类似物rac-GR24前后的表型变化，判断出IPA1在SL通路中发挥重要作用。
图18 体内实验、体外实验（酵母双杂、BiFC、GST pull-down、Co-IP、体外GST pull-down）均证明IPA1和D53存在相互作用。
图19 双荧光素酶报告基因实验验证转录因子IPA1与顺式作用元件GTAC的结合（A、B），双荧光素酶报告基因实验验证D53影响转录因子IPA1对顺式作用元件GTAC的结合（C、D），WB实验（E）检测（C）中的蛋白质水平。本实验证明了D53抑制IPA1的转录激活活性。双荧光素酶报告基因实验可参考文章“天呐！这个实验系统也太强大了吧”。
图20 双荧光素酶报告基因实验、BiFC实验显示IPA1的N端和SBP盒都可以和D53相互作用，但C端不能（A），双荧光素酶报告基因实验显示IPA1 C端结构域足以激活LUC报告基因（B），双荧光素酶报告基因实验显示D53可以抑制全长IPA1和IPA1-ΔN的激活活性，但不能抑制其C端的激活活性（C），EMSA超迁移实验显示D53与IPA1结合并抑制其转录激活活性但D53并不影响IPA1的DNA结合活性（D）。
图21 ChIP-seq数据分析（A）、ChIP-qPCR（B）、EMSA（C）、双荧光素酶报告基因实验-验证转录因子与启动子的结合（D、E），以上实验证明IPA1可与D53的启动子结合并调节其转录。
图22 双荧光素酶报告基因实验验证D53影响转录因子IPA1对D53启动子的结合（A、B），检测图17中ipa1-10和ipa1-3D中D53的转录情况和蛋白表达情况（C、D），外源施加SL类似物rac-GR24并检测D53的转录，结果显示SL对D53的转录取决于IPA1的正常表达（E）。
图23 研究miRNA156与SL信号通路之间的关系（A-E），IPA1介导的SL信号通路（F）。
IPA1与抗稻瘟病
2018年，四川农业大学陈学伟团队、中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋团队、四川农业大学王静团队在Science杂志上发表了题为“A single transcription factor promotes both yield and immunity in rice”的文章，研究发现了IPA1基因在水稻稻瘟病抗病过程中的作用，并揭示了IPA1既能提高产量又能提高水稻对稻瘟病抗性的调控新机制。
图24 IPA1水平的升高可增强水稻对稻瘟病的抗性。将ipa1-1D（即图2中的OsSPL14ipa1基因）引入R320、R441材料，在稻瘟病病圃和正常大田测试产量，结果显示IPA1基因能促进植株在正常大田中10.1-13.3%的增产、能促进植株在病圃条件下30.7-48.2%的增产（A-D），IPA1的过表达株系使植株增强了对稻瘟病的抗性，而其干扰株系对稻瘟病更易感（E-G）。
图25 在感染前后检测IPA1的转录水平和蛋白水平无显著变化（A），检测IPA1的磷酸化水平，在感染后的6-12h达到峰值，在48h下降到正常水平（B），预测IPA1 S163是可能的磷酸化位点，使用IPA1 S163特异性抗体检测到在稻瘟病感染时S163位点的磷酸化模式与IPA的整体磷酸化模式相似。磷酸化检测可参考文章“蛋白翻译后修饰——磷酸化（二）”。
图26 通过EMSA、ChIP-qPCR实验，发现IPA1 S163D（模拟S163位点磷酸化）更倾向于结合WRKY45启动子上的TGGGCC顺式作用元件。
图27 在IPA1 S163D的过表达株系（标为S163D-OE）中，IPA1、WRKY45的相对表达量更高，植株对稻瘟病的抗性增强（A-E），相反，在IPA1 S163A的过表达株系（标为S163A-OE）中，DEP1的相对表达量更高（在原文的补充材料中）。综上，在正常条件下，IPA1结合DEP1（与穗发育有关的基因，可见图8）的启动子，使水稻建成理想株型；当受稻瘟菌侵染时，IPA1被磷酸化，更倾向于结合WRKY45（与抗稻瘟病有关的基因）的启动子，促进其表达，提高稻瘟病抗性。
IPA1与盐胁迫
2022年，中国科学院遗传与发育生物学研究所余泓、王冰团队在Journal of Genetics and Genomics杂志上发表了题为“OsMPK4 promotes phosphorylation and degradation of IPA1 in response to salt stress to confer salt tolerance in rice”的文章，研究发现IPA1负调控水稻的耐盐性，并利用IP-MS方法鉴定出盐胁迫下IPA1的互作蛋白OsMPK4。在盐胁迫下，OsMPK4通过泛素-蛋白酶体途径磷酸化IPA1的Thr180位点，降低IPA1蛋白的丰度。OsMPK4-IPA1的调控模式为理解水稻盐胁迫响应机制提供了新的思路。
图28 通过对之前的材料（见图17）进行耐盐性研究，发现IPA1功能获得突变体ipa1-3D对盐敏感，而功能缺失突变体ipa1-10耐盐性增强（A-C），对其相关的生理生化指标进行检测（D-I）也证实了IPA1是水稻耐盐性的负调控因子。
图29 盐处理导致IPA1蛋白水平下降但磷酸化的IPA1蛋白迅速积累（A、B），质谱数据表明IPA1的Thr180在盐处理下可被磷酸化（C），盐胁迫后1h磷酸化的IPA1达到高峰（D）。质谱可参考文章“你还在小瞧质谱吗？”。
图30 IP-MS技术鉴定出盐胁迫时与IPA1相互作用的蛋白是OsMPK4（A），再通过BiFC、酵母双杂、Co-IP验证OsMPK4与IPA1的互作（B-E），并通过酵母双杂实验发现IPA1的C端结构域与OsMPK4发生相互作用（F）。IP-MS技术可参考文章“筛选目的蛋白的互作蛋白方法之IP-MS”。
图31 之前的文献发现盐胁迫时，OsMKK1可激活OsMPK6，因此作者用BiFC的方法检测了OsMKK1是否与OsMPK4互作，发现可互作（在原文的补充材料中）。WB实验显示不管是在体内还是体外，OsMPK4和OsMKK1DD（可持续激活OsMPK4）均可以磷酸化IPA1（A、C），体外实验证明OsMPK4可磷酸化IPA1的Thr180位点（B），WB实验显示OsMPK4磷酸化IPA1可被26S蛋白酶体抑制剂MG132所抑制（D）。因此，在盐胁迫条件下，OsMPK4是通过泛素-蛋白酶体途径磷酸化IPA1的Thr180位点，降低IPA1蛋白丰度的。
图32 通过遗传学实验鉴定OsMPK4与IPA1的上下游关系，发现OsMPK4位于IPA1的上游。更多可参考文章“辨清敌我，统一战线——确定基因上下游关系”。
图33 OsMPK4-IPA1通路介导的水稻盐胁迫响应机制。
IPA1与耐旱
2023年，福建省农科院水稻研究所张建福团队在BMC plant biology杂志上发表了题为“IPA1 improves drought tolerance by activating SNAC1 in rice”的文章，研究发现IPA1与SNAC1基因的启动子结合后，可直接激活SNAC1的表达，从而调节ROS稳态并赋予植物耐旱性。
编辑IPA1启动子以创制新品种
2022年，中国科学院遗传与发育生物学研究所余泓、李家洋团队在Cell discovery杂志上发表了题为“Targeting a gene regulatory element enhances rice grain yield by decoupling panicle number and size”的文章，IPA1是一个典型的多效基因，在增大穗部的同时使分蘖数降低，限制了其增加水稻产量的潜力，作者利用平铺删除策略在水稻中通过编辑IPA1的顺式调控区，得到了一个可以同时提高分蘖数和穗粒数的编辑材料IPA1-Pro10，成功实现了水稻穗部和分蘖的制约关系的解除，为创制全新的遗传资源提供了有效的策略。
图34 利用平铺删除策略编辑IPA1的顺式调控区，红色表示靶点。
伯小远在前面讲了IPA1基因的发现，和以IPA1为起始拓展出的基因网络，下面的几篇文献是以其它基因为起始，发现了它们与IPA1基因的关系，大家也可以了解一下喔！
IPA1新的等位基因型的发现
2017年，植物生理生态研究所何祖华团队和中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋团队在Nature communications杂志上发表了题为“A natural tandem array alleviates epigenetic repression of IPA1 and leads to superior yielding rice”的文章，作者克隆了调控株型的主效位点qWS8/ipa1-2D，该位点位于IPA1基因上游的一段大片段三元串联重复序列，这一基因组结构变异导致了IPA1启动子区甲基化水平降低，IPA1基因表达量上升，从而使植株出现理想株型的表型，并同时具有适当的分蘖数。
图35 利用超级稻品种甬优12的原始育种品种YYP1（具有IPA性状）和日本晴（NIP）构建的遗传群体，将qWS8定位在SNPM6和SNPM7之间∽3kb的区域。之后作者发现该区域包含三个串联重复，而且与IPA1基因距离较近，并且发现在具有qWS8位点（被命名为ipa1-2D）的植物中IPA1的表达更高。之后通过近等基因系研究ipa1-2D介导的IPA1分子调控机制，发现串联重复序列通过促进染色质开放状态进而促进了IPA1的表达，并且发现可以利用不同的IPA1等位基因的组合达到微调IPA性状的目的。
IPA1上游基因的发现
2017年，中国科学院遗传与发育生物学研究所傅向东团队在Cell research杂志上发表了题为“Non-canonical regulation of SPL transcription factors by a human OTUB1-like deubiquitinase defines a new plant type rice associated with higher grain yield”的文章。上世纪90年代，国际水稻所育成一批“新株型”（new plant type）品种，作者利用正向遗传学方法解析了其基因qNPT1（OsTUB1），并发现在遗传上OsTUB1位于IPA1上游，而由于之前的研究证明IPA1位于DEP1的上游（见图8），因此OsOTUB1-IPA1-DEP1的调控模式为指导育种上实现“好上加好”提供了基础。
IPA1与耐冷
2022年，中国科学院遗传与发育生物学研究所余泓、李家洋团队在Cell discovery杂志上发表了题为“Chilling-induced phosphorylation of IPA1 by OsSAPK6 activates chilling tolerance responses in rice”的文章，作者首先从基因编辑突变体库中发现了ossapk6突变体对冷胁迫更敏感，通过IP-MS发现了与OsSAPK6相互作用的蛋白IPA1，磷酸化实验表明OsSAPK6可以磷酸化IPA1，提高其稳定性。通过遗传学实验发现OsSAPK6在IPA1的上游，又通过RNA-seq找到了IPA1的下游基因OsCBF3。作者揭示了水稻中冷诱导的OsSAPK6-IPA1-OsCBF信号级联，为耐冷性抗逆水稻育种提供了新的线索。
小远叨叨
写这篇文章的原因是最近伯小远听了一场李家洋院士介绍IPA1基因的报告，不得不感叹一个基因竟可以有这么多厉害又强大的功能，整个研究思路又非常的典型，非常值得科研人员学习，同时与我们“伯远生物”公众号常写的基因功能研究思路、转录因子研究思路，以及我司业务非常契合，所以特地整理出来，希望能给大家带来帮助喔！时间与水平所限，如有遗漏的地方，也非常欢迎大家来补充喔！
References：
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Miura K, Ikeda M, Matsubara A, et al. OsSPL14 promotes panicle branching and higher grain productivity in rice. Nat Genet. 2010;42(6):545-549. doi:10.1038/ng.592
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Wang S, Wu K, Qian Q, et al. Non-canonical regulation of SPL transcription factors by a human OTUB1-like deubiquitinase defines a new plant type rice associated with higher grain yield. Cell Res. 2017;27(9):1142-1156. doi:10.1038/cr.2017.98
Wang J, Yu H, Xiong G, et al. Tissue-Specific Ubiquitination by IPA1 INTERACTING PROTEIN1 Modulates IPA1 Protein Levels to Regulate Plant Architecture in Rice. Plant Cell. 2017;29(4):697-707. doi:10.1105/tpc.16.00879
Wang J, Zhou L, Shi H, et al. A single transcription factor promotes both yield and immunity in rice. Science. 2018;361(6406):1026-1028. doi:10.1126/science.aat7675
Zhang L, Yu H, Ma B, et al. A natural tandem array alleviates epigenetic repression of IPA1 and leads to superior yielding rice. Nat Commun. 2017;8:14789. Published 2017 Mar 20. doi:10.1038/ncomms14789
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