● 标题：
革兰氏染色结果的影响因素及原因分析
● 作者：
陆东锋，李金磊，高延玲，方忠意，董鹏，狄元冉，李红婵，吴志明
● 摘要：
为确定生鲜乳中单核细胞增生李斯特菌的快速检测方法，以从河南省奶站及奶牛养殖场抽取的267批生鲜乳为检测对象，分别采用传统培养法、PCR检测法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法进行检测，并以传统培养法为参考标准，对检测结果进行比对确认。结果显示：常规的传统培养法检出阳性3份；PCR法检出阳性5份，经传统培养法确认阳性3份，符合率为60%；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法检出阳性3份，经传统培养法全部确认为阳性，符合率为100%。结果表明，同传统培养法相比，PCR法容易产生假阳性结果，而基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法能够快速、准确检测生鲜乳中单核细胞增生李斯特菌，适合于大批量样品的快速检测。
● 关键词：
单核细胞增生李斯特氏菌 生鲜乳 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 PCR检测 分离鉴定
● 全文内容：
李斯特菌属（Listeria）是一类革兰氏阳性兼性厌氧菌，共有7个种，分别为单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）、伊氏（绵羊）李斯特菌（L. ivanovii）、英诺克（无害）李斯特菌（L. innocua）、威氏李斯特菌（L. welshimei）、斯氏李斯特菌（L. seeligeri）、格氏李斯特菌（L. grayi）和默氏李斯特菌（L. murrayi），其中只有单核细胞增生李斯特菌是人兽共患病原菌。
单核细胞增生李斯特菌在自然界分布广泛，可存在于养殖、种植、加工、贮藏和流通的全过程，能引起人和动物的流产、脑炎、脑膜炎和败血症等，致死率高，严重威胁人和动物健康。2011年8—9月美国有72人感染单核细胞增生李斯特菌，其中13人死亡；据南非《目击者新闻》2018年1月8日报道，自2017年年初李斯特菌病暴发以来，南非共有727人感染，其中61人死亡。
健康奶牛是单核细胞增生李斯特菌的自然宿主。生鲜乳营养丰富，是微生物生长的良好基质。单核细胞增生李斯特菌能随生鲜乳一道分泌，在冷藏条件下仍能生长，因此冷藏生鲜乳存在较大污染风险。鉴于此，对生鲜乳中单核细胞增生李斯特菌的快速检测极为重要。本研究以从河南省奶站及奶牛养殖场抽取的生鲜乳为检测对象，分别采用传统培养法、PCR法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）进行单核细胞增生李斯特菌检测，并以传统方法为金标准，对检测结果进行比较，确定生鲜乳中最适宜的单核细胞增生李斯特菌快速检测方法，从而为生鲜乳风险评估及生产实践提供技术支持。
材料与方法
材料
样品来源。2019年1—8月，抽取河南省奶站及奶牛养殖场生鲜乳共计267批。
菌株。单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株ATCC 19111，购自中国兽医药品监察所。
方法
传统培养法
增菌。取1mL生鲜乳样品加入到9mL灭菌LB1的无菌离心管内，在振荡器上连续震荡2min混匀，（30±1）℃培养（24±2）h；移取0.1 mL，加入到10mL的LB2增菌液内，（30±1）℃培养（24±2）h。
分离。取PCR筛选阳性LB2增菌培养物，划线接种于PALCAM选择平板和李斯特菌显色平板，（36±1）℃培养24~48h。待单核细胞增生李斯特菌在PALCAM培养基上长出小圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈或有黑色凹陷时，选择单个可疑菌落划线接种于TSA-YE平板，（36±1）℃培养18~24h。
动力试验。挑取TSA-YE上纯培养的单个菌落，穿刺SIM动力培养基，25~30℃培养48h，观察培养结果，若不明显可继续培养至5d再观察结果。如果单核细胞增生李斯特菌有动力，则在SIM培养基上呈伞状生长。
生化鉴定。从TSA-YE上挑取适当菌落，于接种液中调制菌液浓度至0.5MCF，然后添加到革兰氏阳性细菌药敏板，采用全自动细菌鉴定/药敏系统进行鉴定。
溶血试验。挑取TSA-YE上纯培养单个菌落，穿刺接种到哥伦比亚血琼脂平板，穿刺时应尽量接近底部，但不要触到底面，（36±1）℃培养24~48h，于明亮处观察结果。如果是单核细胞增生李斯特菌，则呈现狭窄、清晰、明亮的溶血环。
PCR检测
增菌。方法同上。
DNA提取。取LB2增菌培养物1 mL于离心管中，离心弃上清，用1mL无菌去离子水悬浮离心10min；弃上清，再用0.2mL无菌去离子水悬浮，100℃煮沸20 min，-20℃冷冻30min；室温下，待菌液完全融化后高速离心2min，收集上清液即可用于PCR扩增。
PCR扩增以及电泳检测。对检测阳性样品，采用传统培养法进行确认。
MALDI-TOF MS检测
增菌和分离。样品的增菌和分离分别同上。
样品制备。向1.5mL离心管中加入1mL 75%的无水乙醇，从TSA-YE平板上挑取4~6个菌落于离心管中，震荡混匀，超声3min，12000 r/min高速离心2 min，弃去上清；加入50μL 70%甲酸、50μL乙腈，震荡混匀，超声3min，12 000r/min高速离心2min，收集上清液。
点样。用移液枪取1μL上清液，点涂于MALDI靶板孔上，自然晾干；再取1μL CHCA基质（50%CAN、50%H2O、1%TFA）覆盖到样品上，自然晾干，然后将靶板放入质谱仪内进行测量。
质谱分析。设定质谱条件，采集一级质谱图。利用Shimadzu Biotech launchpad软件，对采集到的数据图谱进行分析鉴定。将采集结果导入Mascot数据库中，与标准图谱比对，经过软件计算，给出得分和鉴定结果。对检测阳性样品，同样采用传统培养法进行确认。
结果与分析
传统培养法
经李氏增菌肉汤（LB1、LB2）选择性增菌、PALCAM和李斯特菌显色平板选择性分离，以及动力试验、溶血试验、全自动生化鉴定系统鉴定，共确定单核细胞增生李斯特菌阳性样品3份。单核细胞增生李斯特菌在PALCAM平板上菌落形态见图1。
PCR检测
对267个样品进行二次选择性增菌培养、PCR检测，共检出疑似阳性样品5份，经传统培养法确认阳性3份，符合率为60%。部分PCR检测结果见图2。
MALDI-TOF MS检测
经李氏增菌肉汤（LB1、LB2）选择性增菌、PALCAM和李斯特氏菌显色平板选择性分离以及MALDI-TOF MS鉴定，共确定单核细胞增生李斯特菌阳性样品3份，并经传统培养法确认全部为阳性，符合率为100%。单核细胞增生李斯特氏菌MALDI-TOF MS飞行时间质谱鉴定结果图3略。
讨 论
单核细胞增生李斯特菌感染中，绝大多数为食源性感染。而在一些单核细胞增生李斯特菌散发感染病例研究中发现，50%以上的病例与生鲜乳及其乳制品有关。目前，国内生鲜乳中单核细胞增生李斯特菌监测还未广泛开展，但由于其导致的病死率极高，因此为保证公共卫生安全，对生鲜乳中单核细胞增生李斯特菌的快速、准确检测十分重要。
准确的单核细胞增生李斯特菌检测仍然是传统培养方法，但其操作繁琐、工作量大，检测周期长，难以满足大批量样品检测的需求。PCR检测法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点，但易造成污染，导致假阳性结果产生。MALDI-TOF MS飞行间质谱检测法，具有高通量、快速、准确等特点，能够大大缩短工作时间，减少工作量，因而可以极大提高检测的准确率和工作效率。
本研究中，PCR检测法检出阳性样品5份，最终确定阳性3份。分析原因可能是，PCR检测的是基因，并不能有效区分活菌和死菌，容易受样品中核酸的干扰，从而导致假阳性结果。MALDI-TOF MS飞行间质谱法与传统培养法符合率为100%，检测结果较PCR方法准确。
孟庆玲等对新疆石河子地区249份动物性食品进行单核细胞增生李斯特菌检测，发现平均阳性率为4.8%；陈慧中等对2012—2014年沈阳市509份食品进行单核细胞增生李斯特菌检测，发现检出率为5.1%；吴玲玲等对2015—2017年河南省预包装熟肉制品生产加工过程的430份样品进行单核细胞增生李斯特菌检测，发现检出率为17.0%；时炜等对成都市某乳牛场125份环境样本和原奶样本进行单核细胞增生李斯特菌检测，发现检出率为2.4%；靳晓燕等对22份奶及奶制品进行单核细胞增生李斯特菌检测，发现检出率为4.5%。本研究的生鲜乳中单核细胞增生李斯特氏菌检出率为1.1%（3/267），相对于上述食品及其他研究，检出率较低。这可能与不同地区、不同样品来源、不同生产环境的单核细胞增生李斯特菌污染存在差异有关。
牛场卫生水平差是生鲜乳中单增李斯特菌污染的首要因素。劣质的青贮料、奶牛饲养环境卫生差、奶牛场清洗消毒不到位以及饲养员个人卫生差等都能导致生鲜乳中单核细胞增生李斯特菌的污染，因此饲喂优质的青贮料、保证挤奶过程和奶厅的卫生条件是避免生鲜乳中单核细胞增生李斯特菌污染的重要途径。但由于目前我国对生鲜乳中单核细胞增生李斯特菌的相关报道还不够全面，以后需加强对这方面的调查研究。
结 论
研究发现，MALDI-TOF MS飞行间质谱法相比PCR法，对生鲜乳中的单核细胞增生李斯特菌的检出准确率高，而较传统培养法，又具有高通量、快速等优点，因而能够大大缩短工作时间，减少工作量，适合用于目前大批量生鲜乳样品中单核细胞增生李斯特菌的快速检测。
原文：
https://kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CJFQ&dbname=CJFDAUTO&filename=ZGDW202002021&v=MTcyMjlOSE1yWTlIWllSOGVYMUx1eFlTN0RoMVQzcVRyV00xRnJDVVI3cWZaT2R2RkN2bFVMM1BQeXJQZWJHNEg=
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