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提到高通量测序，我们比较熟知的就是RNA-seq，它是通过提取组织、器官以及一群细胞的混合RNA（bulk RNA）进行测序，得到的是一群细胞转录组的平均数据，这往往忽略掉了细胞群体中单个细胞特异表达的基因信息。随着科技的发展以及需求的增加，单细胞测序技术于2009年应运而生，并于2013年被《Science》杂志评为未来几年最值得关注且可持续发展的技术领域之一。单细胞转录组测序（Single cell RNA sequencing，ScRNA-Seq）是一项在单细胞水平对转录组进行高通量测序和分析的新技术，可获得单个细胞内近万个基因的特异表达信息，同时解决bulk测序无法解决的细胞异质性难题，为辨别生物组织中各细胞的转录组特征、解析单细胞的行为、机制及其与机体的关系提供有力的工具。单细胞测序种类繁多，但转录组测序主要分为两个大方向：①更多的细胞，如10x技术平台，可以构建海量的单细胞测序文库（100000级别），但是只能获取mRNA的3’端信息，也就是说只能获取转录本的部分信息；②测更多的基因，如Smart-seq技术可以获得完整的mRNA信息。今天小编就带大家来了解一下单细胞测序中的Smart-seq技术。
1.Smart-Seq技术的迭代更新
Smart-Seq技术
为什么说Smart-seq（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是可以测更多的基因呢？Smart-seq其实是可以对单个细胞RNA的基因亚型、等位基因等进行大规模测序，并检测mRNA全长的一种单细胞转录组测序技术，它由美国和瑞典科学家共同开发。这种能够从单细胞生成全长cDNA的测序方案，对于等位基因特异性表达、SNV检测或者剪接变体等深入研究来说，具有里程碑意义。但由于当时的技术限制，怎么可能完美无缺呢？所以Smart-seq技术也存在一定的缺陷，如对一些低丰度的转录本扩增效率不佳；同时由于引物的设计问题也可能影响后续纯化及需要更多的细胞进行初步RNA提取等，但就当时而言，该技术已经是获得完整转录本的最佳单细胞测序方案。
Smart-Seq技术的发展史
Smart-seq技术于2012年由Ramsköld团队发表；Smart-Seq2技术于2013年及2014年由Picelli团队改进并发表；Smart-seq3技术则于2020年由瑞典卡罗林斯卡学院的Rickard团队进一步改进并发表。那么接下来我们就具体看一下Smart-Seq2和Smart-seq3技术相对于Smart-seq初代技术有什么改进~
2.Smart-Seq2技术
Smart-seq2技术于2013年被发表于《Nature Methods》，在Smart-seq技术基础之上，通过使用一种模板切换引物探针（TSO）并将其3'末端最后一个鸟苷酸替换为锁核酸（locked nucleic acid，LNA），结合更高浓度的Mg2+和甜菜碱，提高扩增精准度的同时产量也跟得上，只需要50 pg级别的RNA即可满足构建测序文库的需求，同时通过改善MMLVRT和TSO引物，提高转录本的整体覆盖度，实现了高水平的序列模板转换。
技术优势
（1）更强的3'端延伸能力：通过逆转录在 cDNA链的TSO引物（rGrG+G）3'末端最后一个鸟苷酸替换为LNA。增强了热稳定性，在更强的退火温度下，使得非模板cDNA的3'端进一步延伸，完善了转录本的覆盖能力。
（2）更高的cDNA产量：新体系中添加了甜菜碱，可通过提供甲基来增加蛋白酶的热稳定性，并通过破坏DNA螺旋结构消除DNA热融变对碱基对组成的依赖性；同时体系中增加的Mg2+浓度可以保证其与甜菜碱羧酸盐阴离子结合形成离子对，进一步成为DNA稳定剂，在一定程度上提高cDNA产量
（3）更多的加热循环：额外增加10个加热循环（50℃ 2min;42℃ 2min）解开了RNA的二级结构（例如发夹或环），解决了空间位阻导致的酶终止链延长问题。
（4）更广的应用范围：M-MLV逆转录酶更倾向于选择全长cDNAs作为其末端转移酶活性的底物，其在转录到mRNA的5’末端时，会在新合成的cDNA3’末端，多出几个C碱基，使得TSO引物与第一链结合高效合成全长cDNAs，因此每个转录本的所有外显子都能被检测到，后续还可分析可变剪切，还可在转录本层面进行SNP和突变位点分析。
图1 Smart-seq2技术建库流程图
3.Smart-Seq3技术
相较于Smart-seq2技术，Smart-Seq3的建库原理其实大体一致，不同点在于在Tn5酶的tag后面添加了UMI序列，利用独特的手法构建转录组，主要是挑选5’UMI序列的双端序列，将具有相同5’端的序列与不同3’端的序列进行合并，达到延伸转录本的目的，Smart-seq3构建的文库长度主要分布在600-2000bp之间。因此，对于普通单细胞转录组来说，Smart-Seq3技术得到的转录本长度大大增加了，为单细胞水平转录组特征的研究提供了强有力的工具。
技术优势
与Smart-seq2相比，Smart-seq3的技术优势如下：
（1）更长的转录本：Smart-seq2技术在建库时对于转录本长度具有一定的偏向性，大于4kb的转录本建库效率较低，而Smart-seq3技术的建库文本长度主要分布在600-2000bp之间，很好的弥补了Smart-seq2技术的这一缺点。
（2）更高的灵敏度：首先，Smart-seq3在建库前期加入了UMI，这种实验方法提高了对单个细胞的分辨能力；其次，Rickard等人发现，Smart-seq3在SNP分型上的检出显著性高于Smart-seq2，且Smart-seq3对于基因、编码蛋白、lncRNA等检出的显著性都明显高于Smart-seq2[1]。
（3）更低廉的成本：Smart-seq3的成本相较于Smart-seq2降低了很多，可以达到单个细胞在0.5-1欧元左右，而Rickard等改良的Smart-seq3xpress技术更是将单个细胞成本降至0.25欧元[2]。
图2 Smart-seq3技术建库流程图
4.样本类型
样本来源
真核生物的新鲜样本，包括人或小鼠的新鲜组织、细胞系、原代细胞、外周血单核细胞等。
样本量
推荐1~100个细胞/样本，生物学重复建议不少于3个。
细胞质量：细胞活性＞80%；有核率＞70%，结团率＜10%。
5.技术应用领域及国自然申请中的应用情况
应用领域
单细胞转录组测序能够精准反映细胞间的异质性，不但可以预测细胞分化与研究发育轨迹，在各种疾病、免疫、肿瘤、神经科学等领域以及组织、器官、发育研究中发挥着重要作用，实现了对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测，具有广阔的应用前景。
（1）肿瘤微环境及免疫学研究：肿瘤细胞由于基因突变和表达谱不同而产生的肿瘤细胞亚型，肿瘤中心的细胞，肿块边缘的细胞和肿块周围的细胞，乃至远端转移的细胞，其转录组等遗传信息存在差异，借助Smart-seq技术获得不同亚型肿瘤细胞的基因表达数据，为癌症患者的诊断、临床治疗以及疾病机制研究提供有力的数据基础。除此以外，该技术还可在免疫学研究中针对少量分选的细胞，扩增出每个单细胞全长转录本，从而获得针对不同抗原的免疫细胞的特异性表达信息，实现肿瘤组织的免疫学研究。
（2）绘制精细化表达图谱：Rickard等研究发现[1]，使用人类细胞图谱（HCA）基准样品（包含人外周血单核细胞（PBMC），HEK293T，小鼠NIH3T3，狗MDCK细胞）进行Smart-seq3测序，发现物种细胞类型可被清楚分离，使传统较难分离的细胞类型被分离，实现了对特定细胞的更高精准度的转录本覆盖，进而可以绘制精细的单细胞表达图谱。
（3）其他应用：Smart-seq2技术还可通过应用有限的细胞，检测早期胚胎发育过程中不同阶段的基因表达的差异；同时也可将该技术用于植物单细胞研究。由于有些植物单细胞体积过大或过长，并不适合10x平台，因此可借助流式或者显微分选出单细胞后，通过Smart-seq2技术分析植物特殊细胞、繁殖体形成过程中单个细胞层面的特异性基因表达信息。
国自然基金中的应用情况
在国自然申请过程中，单细胞测序技术的应用情况又是怎样的呢？随着技术的突破与发展，国自然研究课题中，涉及诸多热门技术，也包括单细胞转录组测序技术。小编我通过检索并分析中标题目后发现，近几年关于单细胞测序的国自然基金中标项目中，包括但不限于炎症、肿瘤免疫、肿瘤异质性以及肿瘤微环境等方面的研究，包括浙江大学、复旦大学、中山大学已经有单细胞组学相关技术的研究课题，图4中单细胞测序申请数量虽然在2022年有所下降，但总体还是呈现增长趋势，相信2023年以后，将会涌现更多基于单细胞测序的研究课题。
图3 单细胞测序国自然中标题目
图4 单细胞测序技术国自然年度中标量
6.总结
总之，Smart-seq/2/3技术作为可构建全长转录本的单细胞技术之一，可帮助研究者们探究单细胞水平上的转录本特性，为我们研究细胞的异质性、细胞发育、肿瘤微环境、精准医疗带来了巨大的进步，实现了从混合细胞到单细胞的水平研究的跨越，进一步揭示了生物体微观视野的变化规律。
参考文献
[1]Hagemann-Jensen Michael,Ziegenhain Christoph,Chen Ping et al. Single-cell RNA counting at allele and isoform resolution using Smart-seq3.[J] .Nat Biotechnol, 2020, 38: 708-714.
[2]Hagemann-Jensen Michael,Ziegenhain Christoph,Sandberg Rickard,Scalable single-cell RNA sequencing from full transcripts with Smart-seq3xpress.[J] .Nat Biotechnol, 2022, 40: 1452-1457.
[3]Sun Yu-Meng,Chen Yue-Qin,Principles and innovative technologies for decrypting noncoding RNAs: from discovery and functional prediction to clinical application.[J] .J Hematol Oncol, 2020, 13: 109.
[4]Wang Nayi,Zheng Ji,Chen Zhuo et al. Single-cell microRNA-mRNA co-sequencing reveals non-genetic heterogeneity and mechanisms of microRNA regulation.[J] .Nat Commun, 2019, 10: 95.
[5]Pai Joy A,Satpathy Ansuman T,High-throughput and single-cell T cell receptor sequencing technologies.[J] .Nat Methods, 2021, 18: 881-892.
原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/S7lF_suCNKcTCvItC79jBw返回搜狐，查看更多
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