感染病现状
全球每年约有1500万人死于感染。 目前，感染性疾病仍然是全球公共卫生重大威胁，据世界卫生组织( WHO) 统计数据显示，全球每年约有1500万人死于感染，约占全球每年总死亡率的25.5%。尽管在过去几十年里，针对病原体的治疗与疫苗接种大大降低了感染性疾病的影响，但随着新发病原微生物的出现、耐药病原微生物的增多以及免疫抑制宿主的增加，感染的发病率和死亡率仍居高不下。
诊疗现状
病原学诊断始终是感染性疾病诊断中最重要的环节。传统的病原学诊断是临床医师根据患者的临床表现做出一系列鉴别诊断，然后针对这些进行检测，通常一项检测只能对应一种病原。通常，细菌/真菌感染一般以培养为主，而病毒感染则以PCR检测 与血清学检测（有窗口期）为主，传统病原学检测阳性率和通量均较低，较为耗时，且通常只能针对一种~十几种的病原检测，因此一般仅适合于临床轻度感染的病原学诊断。
- 常规病原微生物检测技术对比 -
NGS技术在临床病原体检测中大放光彩
近年来，随着高通量测序 技术，也称新一代（或下一代）测序技术（next-generation sequencing, NGS）的迅猛发展，在操作流程不断简化、检测通量不断增长的同时，检测成本也大大降低，使其在感染病原体检测中呈现出一定的技术优势，并得到越来越广泛的应用。当前，基于NGS鉴别微生物的主要方式有两种：宏基因组测序（mNGS）与病原体靶向测序（tNGS）。
01
宏基因组测序
(Metagenomics Next Generation Sequencing,简称mNGS)
2014年mNGS被首次用于临床感染患者的病原学诊断，成功挽救了一名14岁男孩的生命，至此，mNGS在临床上的研究和应用越来越多。mNGS相比传统病原学检测，无需预设，无偏好性，通过直接提取临床样本中的DNA/RNA，进行高通量测序，经过专用病原数据库比对与生信分析，可一次性完成细菌，真菌，病毒和寄生虫等病原体的检测。 具有检测耗时短、无偏倚、广覆盖等优势，在感染性疾病病原诊断方面发挥着越来越重要的作用，尤其适用于疑难危重、免疫缺陷或疑似感染罕见、新发病原体等特殊患者的病原诊断。
◆mNGS检测改善了中枢神经系统感染的诊断
2019年美国加州大学Charles Chiu团队在新英格兰医学杂志发表的“Clinical Metagenomic Sequencing for Diagnosis of Meningitis and Encephalitis ”研究，针对脑膜炎和脑炎患者的脑脊液（CSF）样本进行检测，通过比较mNGS试验与常规试验的检测结果，对于通过CSF的直接检测进行的感染性诊断， mNGS的PPA（阳性符合率）为80.0%，NPA（阴性符合率）为98.2％，而常规检查为67.5％和99.4%。mNGS检测改善了中枢神经系统感染的诊断，并证明了mNGS在临床患者检测的潜在用途。
◆mNGS提高ICU重症肺炎患者诊断准确率和生存率
上海市第一人民医院 王瑞兰教授团队开展的一项研究共纳入178例重症肺炎患者，首次探讨了mNGS早期提供临床病原学证据与ICU重症肺炎患者生存情况之间的关系。与传统方法相比，mNGS可以提供更快速准确的病原学结果，尤其是对苛养的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、产黑色普氏菌的诊断价值明显，同时在混合感染的诊断方面也具有明显优势。通过mNGS早期明确诊断后，临床据此结果调整患者治疗方案，患者28天和90天的生存率均有提高，90天生存率更是从57.7%提高到83.3%。
◆mNGS可快速、准确鉴别罕见/新发病原
耶氏肺孢子菌在临床诊断中极其缺乏病原体诊断的金标准。G试验、血清乳酸脱氢酶 升高虽然无明显特异性，但通常当此2项检测为阴性时，可作为肺孢子菌的排除依据。最近的研究发现，血mNGS肺孢子菌的灵敏度（94.59%）及特异度（100%）均比G试验联合血清乳酸脱氢酶（灵敏度89.19%，特异度56.0%）高，尤其是特异度。Wu等通过mNGS检测出29例耶氏肺孢子菌感染的患者，其中仅有8例通过Wright-Giemesa染色涂片检测到。Gu等、Chen等报道了在鹦鹉热衣原体肺炎的病例中， 常规病原体检测方法难以检出，而利用BALF mNGS检出鹦鹉热衣原体，从而减少诊断的延误，及早采用精准的抗感染治疗。在mNGS检测之前利用传统病原学方法未检测出任何重要的病原，利用mNGS提供了有力的感染依据。
◆mNGS还能够提高免疫抑制患者的治疗成功率
复旦大学附属华山医院张文宏教授团队纳入108例接受激素治疗的疑似免疫抑制患者，对所有患者同时进行常规微生物检测（CMT）和mNGS检测，结果发现 基于mNGS检测结果调整抗生素方案的患者治疗成功率（81.8%）显著高于使用经验性抗生素治疗的患者（52.6%）。对于多重感染病原体的诊断，相比于CMT，mNGS缩短检测时间近半；类固醇激素累计用量>1000 mg，CMT阳性率显著下降，mNGS无影响。
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mNGS虽然具有检测耗时短、无偏倚、广覆盖等优势，但同时也存在一定的局限性。首先，mNGS检测成本较高。其次，由于临床样本中人源核酸的占比较高，导致病原微生物检测灵敏度降低，也使得其耐药、毒力基因存在漏检风险。再者，由于mNGS测序是随机片段测序，测序时未必覆盖分型区段，可能导致近源病原体无法精准分型。针对mNGS方法在临床上检测灵敏度和成本的诸多问题，tNGS逐渐进入临床视野。
02
病原体靶向测序
(Targeted Next-generation Sequencing ，简称tNGS)
tNGS将“PCR”和“NGS”的优势结合，采用超多重PCR正向富集目标病原，可在增加样本中病原微生物信息、提高灵敏度的前提下大大减少测序数据量，从而实现性能及成本的双重优化。 一般应用于院内感染筛查，可覆盖临床最常见的95%的病原体。
03
mNGS/tNGS如何选择
宏基因组测序（mNGS）与靶向测序（tNGS）都是基于高通量测序技术和其他辅助分子检测技术的病原检测策略。两者的区别在于为NGS准备或提供不同的检测靶标。应用层面，最大的区别是不同的病原种类覆盖范围和检测成本。
- tNGS&mNGS技术比较 -
二者敏感性、特异性、准确性等检测性能指标，目前少有全面系统的评价，相关研究结果分享如下：
1）胡鹏教授团队对2021.2-2021.7月期间在重庆医科大学附属第二医院的102名住院患者，进行临床特征、辅助检查收集和样本采集，包括血液、痰、支气管肺泡灌洗液（BALF）、胸腔积液和淋巴结组织等，同时进行mNGS和tNGS检测。
研究提示，总体上不同样本tNGS和mNGS的微生物检出率没有显著差异（82.17% vs 86.51%，P=0.41）；其中，痰液（97.14% vs 90.91%，P=0.28）、BALF（80.95% vs 90.48%，P=0.08）、胸腔积液（均为33.30%）的微生物检出率也没有显著差异。mNGS额外检出了tNGS panel中未包含的20种微生物，而tNGS检出了20例鼻病毒A/B/C（RNA病毒），但mNGS（DNA流程）未检出。
据此推断， 目前tNGS在呼吸道病原微生物检测方面的效能与mNGS相当。mNGS的检测谱更广、病原覆盖面更全，tNGS在特定病原检测有更高的适用性。
2）研究对201例BALF标本进行tNGS和mNGS检测，通过与综合临床标准（常规病原学检查、回顾性分析及正交试验）进行比较，以评估两种方法在病原体检测中的性能。
mNGS流程从173个标本中检测到了2995个潜在病原体(2860个细菌、4个分枝杆菌、98个病毒、18个真菌和15个寄生虫)，28份标本检测为阴性。tNGS流程从123份BALF体液标本中鉴定出294种潜在病原体（247种细菌、1种分枝杆菌、43种病毒和3种真菌)；78例标本检测为阴性。tNGS的总体准确率为65.6%，mNGS的总体准确率为67.1%。通过两种NGS方法均检出了常规检测方法未检出的病原体。 总体而言，mNGS和tNGS对细菌、真菌和病毒的检测范围相当。两个检测流程的重现性为100%。
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◇ 总 结 ◇
无论是传统病原检测还是NGS检测，各种检测策略各有所长，短期内，mNGS/tNGS不太可能取代传统的诊断方法，但在某些临床情况下，它可能是一种补充性的并且有必要的检测手段。因此，如果将mNGS/tNGS与传统培养、其他分子生物学以及血清学检测等方法联合使用，通过综合分析，可能能真正地实现感染性疾病的快速、精确诊断，从而让更多医生和患者获益。
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