纳米载药体系由于具有特殊的理化性质而被广泛应用于疾病治疗。然而,传统的合成纳米颗粒无法跨越天然屏障,且难以逃避免疫监视,因此在临床应用中副作用较大。仿生纳米颗粒由天然材料改造或以化学方法模仿生物结构的关键特征制备获得,在化学、物理或形态学上与生物学结构具有相似性,因此在惰性排斥、克服屏障和活性作用三方面表现出优异的智能化递送性能,可用于更加高效安全的药物递送。总结仿生纳米颗粒用于药物递送的设计原理,阐述四类仿生纳米载药体系的制备方法,归纳其应用于罕见病、神经退行性疾病、肿瘤、抗病毒疫苗研发和其他靶向治疗等领域的研究进展,并对该领域研究面临的应用挑战、潜在解决方案和未来研究方向进行展望。
载药纳米颗粒具有特殊的理化性质,可以改善药物溶解度、增加药物半衰期、靶向组织或细胞以及实现药物缓控释放。然而,现有载药体系难以满足多种疾病治疗的需求。例如,利用抗体修饰在载药纳米颗粒表面等方法可以获得一定的靶向性,但安全性、难以逃避免疫监视和有效的特异性等问题仍然存在。因此,需要开发新一代智能化药物输送系统以实现药物在体内的高效利用。该系统需要具备三方面特征:一是惰性排斥,纳米颗粒以物理方式保护掺入的药物免受破坏性因素如氧气、光、酶等的破坏;二是克服屏障,可以跨越天然生物屏障和克服细胞内吞障碍;三是活性作用,即特异性激活目标生物学过程。此外,药物递送系统的安全性也是临床治疗中要考虑的关键因素。然而,简单的化学合成方式很难获得满足上述要求的载体。
仿生纳米载药体系是来源于自然灵感和基于天然生物材料特性设计载体,以仿生生物材料为基础设计的具备载药功能的纳米颗粒,在化学、物理或形态学上与生物学结构具有相似性,在惰性排斥、克服屏障和活性作用三方面表现出优异的智能化递送性能[1]。近年来,仿生纳米载药体系得到了广泛应用,并获得了积极的疾病治疗效果,在研发新一代智能化药物递送系统方面展现出巨大潜力。综述近年来仿生纳米载药体系的设计原理,总结仿生载体的制备方法,并对仿生纳米载药体系在疾病治疗领域的临床应用进行展望。
1 仿生纳米载药体系的制备
1.1 仿生纳米载药体系的设计原理
以仿生单元的生物属性为标准,可将仿生纳米载药体系的设计原理大致分为:基于天然生物大分子设计的纳米载药体系、细胞和细胞膜相关的载药体系、细胞外泌体等细胞外囊泡载药体系和模仿生物结构的纳米载药体系(图1)。
图1 仿生纳米颗粒设计的基本单元
脂质分子具有亲水的头部和亲脂的尾部,均可用于载药。多肽由非极性、极性或带电荷的氨基酸组成,可用于载药,还可设计多肽介导的靶向药物递送系统[2⇓⇓⇓-6]。聚糖具有带电荷、亲水性强、凝胶形成能力强和生物粘附性强的物理特性,还可设计靶向载体[7-8]。核酸(nucleic acids,NAs)在细胞内根据碱基配对原则、粘性末端的内聚相互作用实现稳定的连接,应用序列对称性最小化的原则可实现自组装[9⇓⇓-12]。
细胞具有天然结构优势和特异性。近年来,细胞-药物、细胞-药物载体杂化体系的建立实现了细胞和药物、细胞和药物载体的共同递送,还可利用微胶囊的方法实现细胞精准递送以解决传统细胞治疗中免疫抑制的问题[13]。从细胞中提取的细胞膜可以作为药物载体,以细胞膜为涂层的仿生纳米材料具有良好的生物相容性和较好的药物递送效率。
细胞外囊泡包括微米级的微囊泡和30~100 nm直径的细胞外泌体,它们是从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体,参与免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应、凝结等重要的生物过程,还参与细胞间通讯,对靶细胞的识别也具有特异性[14-15]。因此,细胞外泌体具有良好的长循环、生物相容性好、免疫原性低等特点,是理想的天然药物载体。近年来,越来越多的研究利用外泌体的天然载体性质,构建符合需求的精准药物治疗体系[16-17]。研究证实,外泌体载药纳米颗粒可通过膜融合的方式将内部载药物质输送至细胞质,这种方式简单且高效[18]。
细胞中构成生物化学反应的最基本单元是细胞器,如线粒体、核糖体、细胞核等。模仿细胞器的结构和功能,补充与病理状况相关的细胞功能障碍,为新型药物递送和疾病治疗提供了新的思路。此外,病毒可与细胞共存,利用病毒对细胞具有很强的侵染性这一生物学特性,可以设计具有高效药物递送能力的仿病毒纳米载药颗粒。
1.2 生物大分子用于药物递送载体的制备
自然界中的生物大分子天然存在分子自组装的现象,因此基于生物大分子的结构,并利用化学方法实现体外自组装,可制备兼具载药功能、靶向作用和一定生物活性的纳米载药体系,即“自下而上”的仿生纳米载药体系。
通过人工合成的方法,脂质分子自组装形成脂质基纳米颗粒,包括纳米乳液、脂质体、固体脂质纳米颗粒等。该方法制备的关键在于利用化学方法形成一定形貌的颗粒,通过物理手段使之形成均一的纳米载药体系。例如,纳米乳液的制备原料包括水相、油相和乳化剂三种化学或生物试剂,通过高压均质法或超声法、相转变温度法、反相乳化法、自乳化法等可制备均一的纳米乳液。目前,脂质体的制备工艺日趋成熟,可以适应多种药物递送的需要。脂质体的制备原料包括磷脂和胆固醇,通过薄膜分散法、溶剂分散法和其他物理手段水化脂质。纳米结构脂质载体的制备方法通常是在水溶性表面活性剂/乳化剂的水溶液中,对液体脂质和固体脂质的混合物进行纳米乳化,通过高压均质、溶剂乳化/蒸发、微乳化、超声波化或高速均质、喷雾干燥和微流体技术等进行物理分散。
肽由于其自身的官能团和分子结构可进行自组装。通过选择肽序列可以在一定程度上预测自组装特性,还可通过外部触发因素(如温度、pH值和电场)从分子水平进行操纵,因此可根据需要人工合成和组建多种类肽纳米载药系统,还可形成环境响应型药物递送系统。制备肽纳米载药颗粒的自组装有多种方法,自组装发生在肽和颗粒所在溶剂的蒸发过程中,因此一般通过对肽和溶剂的选择来影响最终产品的形状,如通过气相沉积法、超声波溶解和加热的方法获得肽自组装纳米管,通过调节离子强度的方法制备肽纳米线。多糖纳米载体的制备方法包括乳化、自组装等。多糖纳米载体的自组装途径主要包括聚电解质吸附自组装、基于多糖聚合物的两步法自组装以及聚合/自组装联合的一步法途径。核酸载药纳米颗粒的自组装是利用DNA片段碱基互补原理,将特定位置修饰过的DNA片段放在溶液里搅拌,自然形成设计图案。通过这种方法和原理,多种类纳米剂型如无机材料DNA杂化物和DNA-聚合物/脂质杂合缀合物得以制备,从而满足多种疾病治疗的需求。
1.3 细胞膜类药物载体的制备
“自上而下”策略制备药物载体,是从自然学习获得仿生纳米药物载体的一种方式。从活细胞开始删减要素,逐步剔除系统复杂度,利用生物工程和化学方法制备精妙的仿生载体[32]。该策略既减轻了宿主的免疫反应,又保留了自然细胞的生物学功能。近年来,不同类型的细胞膜作为药物载体的涂层研究已经被报道,如红细胞、间充质干细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞和癌细胞等[33⇓⇓-36]。细胞膜包覆的内核纳米颗粒混合物载体的制备包括独立制备和物理方法制备复合物载体两个步骤。以红细胞膜纳米颗粒的制备为例,内核纳米粒子由纳米沉淀法的自组装法制备获得,外壳红细胞膜通过低渗处理、反复冻融或超声波破坏获得,然后将两者混匀,经脂质体挤出器通过多孔聚碳酸酯膜反复挤压。该方法制备的纳米颗粒既具有纳米载体本身的理化性质,又具有天然细胞的生物学性质。
1.4 细胞外囊泡药物载体的制备
目前最常用的外泌体提取方法是差速离心法、尺寸排阻色谱法(size-exclusion chromatography,SEC),此外还有聚合物沉淀法、超滤法、免疫亲和捕获法、基于微流控的分离方法等[37]。外泌体载药方法可分为分泌前载药法和分泌后载药法[38]。分泌前载药法处理的对象是外泌体的供体细胞,通过共孵育的方法使药物或载药颗粒被细胞内吞,从而提取并获得载药外泌体或外泌体-载药纳米颗粒复合物。该方法保留了外泌体结构和功能的完整性,但是载药率低。分泌后载药法类似于细胞膜涂覆的复合物载体的制备,首先需要独立获得外泌体,将外泌体作为一个简单的膜结构囊泡模型,利用转染试剂、电穿孔、表面活性剂处理、挤出、超声和冻融循环等暂时破坏膜结构进行载药,这种方法适于批量生产,但物理或化学的方法对外泌体表面蛋白和外泌体完整性会造成一定程度的破坏。这些方法同样适用于外泌体涂覆的载药纳米颗粒复合物的制备,可采用共孵育和超声的方法制备未成熟树突状细胞为外壳的核酸载药纳米颗粒复合物。此外,共孵育和超声的方法还可通过亲疏水作用将该靶向配基自动插入外泌体的膜中,这种靶向外泌体复合物可用于脑部病灶靶向治疗[18]。
1.5 模仿生物结构的纳米颗粒制备
人工合成的仿细胞器纳米颗粒可利用分子组装策略构建多级组装体,其中最有代表性的是仿线粒体纳米颗粒。研究人员利用可除去模板法化学合成了固载金纳米颗粒的中空介孔二氧化硅微粒,这种载体具有类线粒体内膜的多层级结构,将其载入重组ATP合酶,在金纳米颗粒的催化作用下催化合成ATP[39]。组装混合结构中纳米酶催化级联反应,以实现线粒体模拟氧化磷酸化,为代谢障碍相关的疾病治疗提供更多可能。此外,利用天然细胞膜的生物区隔作用可制备仿生纳米反应器,其外部通过癌细胞膜涂层作为类似生物细胞结构的由膜封闭的隔室,内部利用改性的多孔硅纳米颗粒(porous silicon nanoparticles,PSiNP)作为酶的限域环境,可实现化学物质的流入、流出以及防止酶的外泄。近年来,研究人员发现外泌体也可充当有效生物催化级联的纳米反应器,成功封装多种酶,并在质膜中组装最小的电子传输链,提高催化级联活性,实现模拟自然界自身细胞器的进步[40]。
通过基因工程的方法制备病毒样颗粒可保留病毒表面完整性,该过程一般包括病毒结构基因构建与克隆、宿主表达系统选择、分离纯化和分析鉴定等。通过人工合成的方法构建具有表面结构的无机纳米粒,如表面粗糙的二氧化硅粒子或金属粒子等,可模仿病毒的表面特性。随着对病毒跨越生物屏障和入侵细胞机理研究的深入,研究人员通过化学合成树状大分子模拟病毒穿膜肽的结构与功能,从而可控组装仿病毒纳米载体,形成具有非致病、可穿膜并可定向传递的药物递送系统[41]。此外,还可以利用天然病毒外壳建立生物矿化,如进行噬菌体表面的磁性纳米颗粒连接,在天然病毒内矿化粒径均一的金纳米颗粒或金银纳米颗粒,形成核壳型纳米颗粒,不仅可实现尺寸和形貌的精确控制,还提供了多功能整合的平台[42-43]。
2 仿生纳米颗粒在疾病治疗中的应用
重大疾病对仿生载体的需求一方面源于药物本身易降解的局限性,另一方面源于治疗方法需要较高的特异性。仿生纳米载药体系既可提供核酸药物等免受环境影响的天然屏障,又具有天然生物学特异性,因此可为疾病治疗提供高效药物载体。
2.1 罕见病治疗
罕见病治疗是一个世界性难题,我国儿童罕见病药物依靠进口,价格昂贵,给患者带来极大的经济负担。随着重大疾病病理因素和疾病相关基因鉴定的深入研究,针对致病基因的罕见病治疗药物逐渐进入市场[44]。基因药物在体内的递送影响其临床应用,主要原因在于裸露的核酸在体液中易被核酸酶降解而清除,电荷特性和小分子特性使其不容易在治疗部位积累,因此需要高效安全的静脉注射给药载体。
近五年来,已有腺相关病毒载体(adeno-associated virus,AAV)和脂质纳米颗粒载体作为静脉注射药物载体上市,很多药物正在进行临床试验。例如,脊肌萎缩症主要是由SMN1基因(运动神经元存活基因1)7和8外显子纯合缺失或点突变致病。2019年,OAV101注射液(Zolgensma)进入市场,这是一种AAV基因治疗药物,解决了诺西那生钠注射液等腰椎穿刺鞘内给药的痛点。Patisiran是全球第一款siRNA药物,于2018年上市,用于治疗成人遗传性甲状腺素介导的淀粉样变病引起的多发性神经病(hereditary transthyretin amyloidosis,hATTR)[45-46]。Patisiran以siRNA为有效成分,以脂质纳米颗粒为递送载体,能够对siRNA药物进行靶向递送,实现了肝脏细胞基因沉默。Givlaari也是一种用于治疗急性肝卟啉症(acute hepatic porphyria,AHP)成人患者的siRNA药物[47-48]。
2.2 神经退行性疾病治疗
神经退行性疾病的重要递送问题在于克服血脑屏障和药物在脑部细胞的精确递送。受生物体内细胞穿透肽对血脑屏障透过作用的启发,研究人员构建了一种仿细胞穿透肽功能的聚合物纳米颗粒载体,可协助siRNA药物跨越血脑屏障,靶向神经元递送,解决了siRNA药物的递送瓶颈,在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)治疗中表现出了优异的治疗效果[49]。随着工程纳米材料在生物医学应用中的快速发展,合成载体的生物安全性问题要求对其生物相容性和细胞毒性进行适当评估[50]。使用仿生纳米载药系统可降低脑部用药的安全风险。
神经元细胞的细胞膜可通过粘附于小分子的膜表面血管细胞与小胶质细胞表达的α4β1整联蛋白之间的特异性相互作用来靶向小胶质细胞。根据这种自然灵感,通过构建神经元细胞的细胞膜涂覆的无机纳米颗粒用于槲皮素载药,可靶向和调节小胶质细胞治疗帕金森病[51]。细胞外泌体是天然来源的纳米级囊泡,已被研究应用于siRNA的递送。研究人员构建的未成熟树突状细胞来源的细胞外泌体杂化载药颗粒可显著清除免疫激活,并用于神经退行性疾病的免疫调节,提高帕金森病的药物治疗效果。
2.3 肿瘤治疗
肿瘤治疗的难点在于癌细胞生长速度过快,不能准确定位靶向肿瘤组织和细胞,并且在杀灭肿瘤细胞的同时会损伤正常的组织和细胞。仿生纳米药物载体具备天然靶向损伤位点或治疗位点的作用,有些还具有促进肿瘤治疗的生物学功能。
受血小板在肿瘤血栓形成和肿瘤转移中与循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)相互作用并调节免疫反应的固有能力的启发,研究人员设计了免疫检查点特异性抗体PD-L1(aPD-L1)与血小板表面结合形成aPD-L1偶联的血小板(P-aPD-L1)药物递送系统,突出了血小板在免疫检查点传递和阻断免疫检查点进行靶向抗肿瘤治疗的优点。外泌体也具有一定的免疫功能和天然靶向肿瘤细胞的作用[54]。例如,树突状细胞分泌的外泌体在小鼠体内可以引起肿瘤排斥,肿瘤细胞来源的外泌体可将其表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)抗原肽复合物传递给树突状细胞,增强抗肿瘤免疫。受白细胞的生物学特性及其对免疫反应安全性的启发,开发白细胞涂层的纳米颗粒用于癌症治疗,其天然对肿瘤内皮的主动识别能力使其可以高效递送抗肿瘤药。仿病毒纳米颗粒能够刺激T细胞和B细胞免疫反应,引起机体的先天免疫,偶联或包载免疫刺激物(免疫佐剂)可进一步提高机体的炎症水平,增强T细胞活化,融合肿瘤抗原后还能引发肿瘤抗原特异性免疫反应,进一步提高抗肿瘤疗效[55]。
2.4 抗病毒疫苗研发
仿生纳米载药系统便于传递功能化或包囊化的佐剂、抗原和表达抗原结构的遗传物质,从而使机体对病原体产生免疫力。仿病毒纳米颗粒具有多种疫苗接种优势,可增强摄取和更有效地刺激免疫反应。
新型冠状病毒肺炎的暴发对mRNA纳米疫苗的研发提出了新的要求。传统的mRNA疫苗使用合成纳米材料进行物理包埋以保护和传递mRNA,使其免受降解并被高效递送至受体细胞。其中最常见的是脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP),然而其递送效率受内吞时内涵体途径的限制。仿病毒纳米颗粒利用病毒的高侵染性递送mRNA。研究人员通过甲型流感病毒侵染细胞,获得表达血凝素蛋白的细胞膜,可用于聚合物载mRNA纳米粒子的涂覆,从而实现直接胞质递送[56]。针对多种病毒、疾病的预防性疫苗和治疗性疫苗已处于临床试验阶段,已有病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)制备的疫苗已获批上市,如HBV疫苗(Engerix-BV® 、Enivac-HBV® 等)。相比于传统疫苗,新型VLPs疫苗结构规则、自组装性强、颗粒均一性好、颗粒载体装载率大、生物相容性高、质量稳定、安全可靠,且可根据需求进行精准修饰,免疫优势巨大[57]。
2.5 其他特殊靶向治疗
受一些生物学过程的启发,血小板、红细胞、中性粒细胞、树突状细胞等细胞天然具有靶向特性而被开发利用。细胞膜涂覆的仿生纳米颗粒系统可继承细胞的趋向性,这使得此类仿生载药颗粒天然具有靶向性。
红细胞具有归巢到脾脏并与抗原递呈细胞相互作用的先天能力,有研究设计了红细胞涂层的纳米载药系统可有效地将抗原递送到脾脏树突状细胞(dendritic cell,DC),在小鼠体内成功引起DC的成熟和活化、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)抗体的产生和T细胞免疫应答,并且没有明显的毒副作用[58]。基于血小板在止血和炎症反应中的重要作用,可设计血小板细胞膜涂覆的纳米颗粒定向到达组织损伤部位进行药物递送,如用于出血动物模型的止血、靶向并修复心肌梗死损伤部位[59]。造血干细胞-血小板细胞复合物携载PD-L1修饰的造血干细胞归巢到骨髓,血小板在白血病细胞处被激活并释放抗体。中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒继承了其抗原和相关膜功能,这些纳米颗粒可以靶向中性粒细胞并释放去中和促炎的细胞因子来抑制炎症,深入到软骨基质中提供强有力的软骨保护,防止关节损伤。外泌体兼具靶向作用和细胞调节作用,树突状细胞外泌体可靶向树突状细胞。外泌体囊泡内包含多种miRNA,当其与细胞相互作用时,miRNA作为信号分子传递给受体细胞,调节细胞功能。例如,巨噬细胞来源的外泌体携带的miR-150可用于刺激内皮细胞迁移,干细胞来源的外泌体携带miR133b可引起神经突起生长增多,间充质干细胞来源的外泌体可直接进行尾静脉注射,用于治疗多发性硬化症[60]。
3 总结
细胞是生物体结构和功能的基本单位,是仿生纳米材料设计的资源宝库。通过模仿自然系统,研究人员采用“自上而下”或“自下而上”的方式设计和制备了多种仿生纳米颗粒,其来源于生物体自身或模仿生物体各单元的基本结构,使其有望在安全性方面获得突破,发展成为新一代的临床药物制剂。
“自下而上”的仿生纳米药物载体中,脂质体的临床应用较为广泛,但是脂质材料的低稳定性和苛刻的化学修饰条件限制了其在仿生递送中的进一步开发和更广泛应用。未来可以使用结构类似的两亲嵌段共聚物作为脂质替代物来组装聚合物囊泡,并通过调控总分子量、嵌段比例等调节由嵌段共聚物形成的囊泡性质。
“自上而下”的仿生纳米药物载体制备方案在临床上难以被广泛应用的原因在于天然细胞工程药物制剂的扩大生产受限,生产过程中难以保持天然成分的完整性和活性成分的有效性。因此,应该建立适当的标准、可重复的修饰方法和可靠的分析技术来解决与这些细胞工程技术相关的问题。仿生载体的储存也是一项难题,外泌体在-80℃保存较好,在4℃条件下外泌体会聚集和结构破坏,这会增加运输和储存的成本。仿病毒纳米颗粒疫苗的应用有望解决目前新型疫苗生产周期较长、开发成本较高、热稳定性较差、冷链储存和运输成本高等问题。
此外,仿生纳米载体的安全性具有一定的不确定性。例如,过量使用免疫细胞膜包裹的纳米粒可能通过与免疫系统的相互作用诱发或加重炎症,从而可能导致病理介质的释放。间充质干细胞来源的外泌体具有抗炎和抑制免疫的作用,基于此种外泌体的疗法有可能直接或间接诱发肿瘤或加速已有肿瘤的进程。对外泌体进行载药等破坏膜的操作时,存在改变膜蛋白方向的风险,这可能造成免疫系统的识别,继而引发不良反应。因此,未来可以实现脂质体与外泌体进行膜融合以提高载药能力,并降低外泌体用量或尝试外泌体的全人工合成。同时,要选择对外泌体含量和组成影响较小的外泌体表面修饰方法,以减少其带来的细胞毒性等问题。
未来以仿生为导向的药物递送设计需要结合多学科的专业知识,如聚合物、药学、生物学、工程学等,要合理设计和合成对生物组织具有反应性的智能材料,用以保护药物运输和按需释放生物活性分子。此外,还需要对药物进入生物体的递送机制、药物代谢动力、生物组织分布以及与细胞的相互作用、免疫反应等深入理解,验证其体内安全性和有效性。希望在不久的将来,更多的仿生纳米颗粒可以进入临床药物制剂研究,为重大疾病患者带来福音。
文献来源
刘霖颖, 沈洁, 陈亮, 张虎成, 赵新颖. 仿生纳米载药体系的制备及在疾病治疗中的应用*. 中国生物工程杂志, 2023, 43(7): 114-121返回搜狐，查看更多
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