据WHO分析，全世界范围内约有4.66亿听力障碍患者。由遗传因素引起的遗传性聋约占所有听力障碍的60%。听力障碍的致病基因极其复杂，目前已知的致聋基因超过250个，更多的聋病基因还有待发现。某些听力障碍与遗传物质改变导致个体对环境致聋因素（如噪声、耳毒性药物、年龄等）的遗传易感性增强有关。对人类遗传性听力障碍动物模型的构建成功扩展了基因治疗领域的原理验证研究，目前用于聋病基因研究的模式动物有鼠类、斑马鱼、小型猪及灵长类动物等，但由于发育及生理特征的差异，动物实验研究成果有待进一步临床研究验证，未来的研究重点应是推动听力障碍的基因治疗向临床转化。本文就遗传性听力障碍基因治疗的现状、发展前景和挑战等方面进行文献复习和展望。
一、遗传性听力障碍基因治疗的靶细胞和时机
绝大多数遗传性听力障碍与基因结构或功能障碍导致的内耳发育异常有关，针对不同的内耳细胞和基因表达模式，准确选择靶细胞和治疗时机至关重要。目前研究表明，听力障碍基因治疗的靶细胞主要有毛细胞、血管纹细胞、支持细胞、螺旋神经节神经元，针对这些靶细胞的干预存在一定时间窗，一般认为早期基因治疗对听力恢复更为有益。
1.1 毛细胞（hair cells，HCs）
HCs是非分裂细胞，分为外毛细胞（outer HCs，OHCs）和内毛细胞（inner HCs，IHCs）两类，OHCs放大声音信号，IHCs将声波承载的机械信息转换成电信号，然后释放神经递质引起神经纤维兴奋。位于毛细胞顶端的纤毛在听觉传导过程中起关键作用，是毛细胞最脆弱、最易受损的部分。纤毛发育所需的基因在发育早期表达，存在窗口期的限制，导致毛细胞死亡的基因突变会限制基因治疗的可能性。研究证实，超过50%的致聋基因在HCs中表达，HCs是听力障碍基因治疗中重要的靶细胞。
1.2 血管纹细胞（stria vascularis，SVs）
SVs是排列在蜗管外侧壁的上皮细胞，包括边缘细胞（marginal cells，MCs）、中间细胞（intermediate cells，ICs）和基底细胞（basal cells，BCs），主要功能是维持内淋巴液的K+平衡和耳蜗内电位（endocochlear potential，EP）。MCs中的KCNQ1和KCNE1基因编码的蛋白质共同形成K+通道，将K+转运出SVs进入富含K+的内淋巴液，KCNQ1和KCNE1基因突变引起常染色体隐性遗传的Jervell-Lange-Nielsen综合征（jervell and lange-nielsen syndrome，JLNS）。Chang等利用外源kcnq1基因成功使JLNS小鼠的听力恢复，表明血管纹细胞是听力障碍干预的重要靶细胞之一。
1.3 支持细胞（supporting cells，SCs）
SCs是位于毛细胞周围的非感觉细胞，通过缝隙连接相互耦合，在保护和维持毛细胞周围环境的稳态中起重要作用。GJB2基因突变会影响SCs的缝隙连接，是人类常见的致聋基因之一。Yu等成功在gjb2基因敲除小鼠的耳蜗中重建了细胞间的缝隙连接网络，促进了细胞间扩散的恢复。很长一段时间学术界认为哺乳动物毛细胞的损伤是永久性的，而最新的研究成果发现具有祖细胞特性的SCs可再生为毛细胞。因此，SCs是听力障碍基因治疗的靶细胞，可用于毛细胞再生和纠正遗传性听力障碍。
1.4 螺旋神经节神经元（spiral ganglion neurons，SGNs）
SGNs是听觉传入神经元，将来自毛细胞的传入信号编码成动作电位后，通过听神经传输到听觉皮层产生听觉。包括两种类型的SGNs，I型约占SGNs的90％，仅接受来源于IHCs的信号；II型约占5%~10％，可接受来源于绝大多数OHCs信号。噪声、耳毒性药物、遗传因素、神经营养因子3（neurotrophin 3，NT-3）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的缺乏均可引起SGNs的损伤导致听力障碍。促进SGNs存活和再生的基因治疗措施，对SGNs损伤导致的听力障碍患者有益。人工耳蜗将听觉信息传递到中枢神经系统依赖于存活的SGNs，防止SGNs的损伤对人工耳蜗植入患者至关重要。因此，SGNs也是听力障碍基因治疗的重要靶细胞。
二、听力障碍基因治疗的载体系统
基因治疗的开展首先需要有理想的基因治疗载体，已有多种在耳蜗中递送遗传物质的病毒和非病毒载体。
2.1 病毒载体
病毒载体是内耳基因治疗中使用最多的载体，逆转录病毒（retroviruses）载体、慢病毒（lentivirus，LVs）载体以及单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSVs）载体因转染率低、表达低等原因导致其应用逐渐减少。腺病毒（adenovirus，AVs）载体的转染率高、DNA插入区大（可达35 kb）、插入突变机率小，是研究中使用较多的载体，但目的基因表达短暂、易刺激免疫反应、缺乏组织特异性等弊端限制了其在听力障碍基因治疗中的应用。
腺相关病毒（adeno-associated virus，AAVs）载体的毒性和免疫原性较低，可同时转染分裂细胞和非分裂细胞，目的基因表达稳定、易制备、成本低，是目前应用最多、最重要的内耳基因治疗载体。传统AAV载体对内耳细胞的转导率受血清型、导入途径及治疗年龄等多种因素影响，AAV1对乳鼠OHCs和SCs的转导率最高，但仅在导入内淋巴时转导SCs。AAV8主要用于成年小鼠的基因治疗，导入内淋巴时可转导OHCs、IHCs和SCs，但应用到外淋巴时转导仅限于IHCs。人工合成的新型AAV载体，在内耳中表现出极强的转导能力，如Anc80L65、AAV9-PHP.B和AAV2.7m8。Anc80L65可高效转导小鼠的IHCs和OHCs，显著改善传统AAV载体对OHCs转导率低下的问题。Bence György等对USH 3A型听力障碍小鼠进行基因治疗研究表明，应用AAV9-PHP.B载体将野生基因clrn1成功导入内耳并恢复听力，显示出AVV的广阔应用前景，尽管该研究中小鼠的高频听力恢复不理想，由此显示AVV介导的clrn1基因在耳蜗基底部的表达水平较低是下一步需要解决的问题。在灵长类动物中，AAV9-PHP.B可使IHCs和OHCs从蜗底到蜗顶几乎100%的转导，有望应用于人类内耳基因治疗。AAV2.7m8可同时高效转导IHCs、OHCs和SCs，极大地促进内耳基因治疗的发展。
2.2 非病毒载体
在听力障碍基因治疗中应用较多的有脂质体、纳米颗粒聚合物、基因枪和电穿孔技术。脂质体可保护核酸不被降解或中和，易与细胞膜融合，从而促进核酸向细胞质内转运。已有多项研究成功使用脂质体介导内耳的转基因表达，延缓了DFNA3听力障碍小鼠和tmc1小鼠听力损失的进一步发展。
纳米颗粒聚合物易与DNA分子结合形成复合物，通过胞吞作用进入靶细胞后释放目的基因并表达。目前已有多种用于听力障碍基因治疗的纳米颗粒聚合物，如聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）、聚赖氨酸纳米颗粒（hyperbranched polylysine nanoparticles，HPNP）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polylactic/glycolic acid，PLGA），具有较好的生物相容性和可降解性，可通过局部应用将遗传物质递送至耳蜗。经PEI转染的耳蜗具有完整的细胞和组织结构，没有炎症迹象，但转染仅限于有淋巴液流动的间隙。
基因枪（biolistic/gene gun）是一种机械方法，亦称粒子轰击（particle bombardment），通过将目的基因沉积在金属颗粒表面，加速后发射到细胞或组织中，适用于皮肤、粘膜或经手术暴露的组织。美国学者利用基因枪技术将编码非常规肌球蛋白XVa的基因转染Myo15a-EGFP-C2小鼠，成功观察到毛细胞纤毛的顶端肌球蛋白XVa的选择性累积，证明基因枪技术可以用于感音神经性聋的基因治疗。
电穿孔（electroporation）是利用高压电脉冲在细胞膜上形成的瞬时穿孔吸收细胞外的DNA，人工耳蜗植入电极可用于近场电穿孔。能够直接递送大的转基因，诱导内耳细胞的转基因表达，特别是转录因子的异位表达。例如，转录因子Math1可诱导毛细胞和支持细胞感觉簇的形成，转录因子Sox2、Neurog1和NeuroD1可诱导神经元细胞的形成。
非病毒载体是将治疗基因导入内耳的重要补充方法，与病毒载体相比较，具有制备简单、更安全、高负载能力等优势，得到了越来越广泛的应用，但普遍存在转染率和特异性低、转基因表达短暂等弊端。
三、载体导入途径
内耳处于骨迷路的包绕之中，存在血迷路屏障（blood-labyrinthine barrier，BLB），导入内耳的外源基因向其他组织扩散的风险小。治疗载体通过内耳淋巴循环在耳蜗内扩散，有助于转染靶细胞，使得内耳基因治疗具有独特优势。但耳蜗是充满淋巴液的螺旋空间，对内部液体量和成分的改变具有极高的抵抗力，给基因治疗带来了一定困难。
目前听力障碍基因治疗中常用的载体导入途径有以下几种：①鼓阶途径：包括两种导入路径，一是经耳蜗底转开窗注入鼓阶外淋巴；二是经圆窗膜（round window membrane，RWM）穿刺直接注射入鼓阶外淋巴。两种方式均有破坏耳蜗鼓阶、损伤残余听力的危险，因淋巴液外漏引起的残余听力下降，可用筋膜堵塞RWM穿孔消除。②半规管开窗途径：多用后半规管开窗法实现最小范围的转导，主要限于前庭器官，可能会引起短暂的前庭功能障碍。③中阶途径：可直接将目的基因导入内淋巴间隙，对血管纹细胞的转染率较高。中阶途径对毛细胞的转染率较高，在完成转染的同时仅高频（≥32 kHz）有轻微的听力损失。有些研究认为，该途径对毛细胞的转导率与圆窗膜穿刺途径相似，更易引起听力损失，关于这种差异有待进一步验证。④前庭椭圆囊途径：经此途径AAV9-PHP.B载体对乳鼠IHCs和OHCs的转导率最高。⑤圆窗膜渗透途径：由脂质体及聚合物纳米颗粒介导的内耳基因治疗多用此途径，对听力影响较小，但治疗载体不易进入内耳、转染率低。⑥全身应用：操作简单，前提是治疗剂可以穿过BLB到达内耳，脱靶风险较高。
载体导入途径的选择主要取决于靶细胞的部位和类型。例如，JLN综合征的治疗以SVs为靶点，需将载体导入内淋巴间隙。同样如果靶细胞是SGNs，则需要导入外淋巴间隙。对于某些类型的细胞，特别是位于内外淋巴交界处的细胞，可能需要尝试联合应用两种不同的途径，以达到最佳效果，例如RWM穿刺联合半规管开窗途径可提高成年小鼠IHCs转导的效率。
四、遗传性听力障碍基因治疗的方法
听力障碍的基因治疗方法很大程度上取决于其遗传形式，目前常用的基因治疗方法有以下三种。
4.1 基因置换（gene replacement）
基因置换是基因治疗最直接的方式，在确定致病基因后用正常或野生型基因替换缺陷基因，由此恢复缺陷基因造成的功能障碍。该方法适用于双等位基因的隐性突变和功能丧失的显性突变，对能够抑制治疗序列的显性突变效果不理想。首次成功的基因置换治疗是对vglut3基因敲除小鼠的研究，通过导入功能性vglut3基因的方法，成功恢复了治疗小鼠的听力，几乎100％的IHCs被转导。目前已有数项研究利用该方法成功使Usher综合征（Usher syndrome，VSH）小鼠的听力恢复，包括编码harmonin蛋白、sans蛋白和whirlin蛋白的基因缺陷引起的USH1C、USH1G和USH2D。
4.2 基因抑制（gene suppression）/基因沉默（gene silencing）
主要用于显性突变引起的听力障碍，可在转录或转录后水平上发挥作用。在转录水平上，诱导组蛋白修饰或改变RNA聚合酶、转录因子等转录复合物的结合，从而抑制转录延伸，例如gRNA-dCas9DNA复合物、Kruppel相关抑制子盒（kruppel-associated box repressor，KRAB）等。在转录后水平，主要是通过反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）和RNA干扰（RNA interference ，RNAi）途径阻止基因表达。ASO可选择性结合mRNA，阻止mRNA加工或使之降解。Lentz等向USH1C 216G> A突变小鼠的腹腔内注射ASO-29，使其前庭和听觉功能恢复，但关于ASO的作用机理及其转移到内耳的方式，仍然有许多悬而未决的问题。RNAi途径是一个生物过程，常用小干扰RNA（siRNA）和microRNA（miRNA），siRNA比miRNA更具特异性，但miRNA可同时调节多个基因的表达。已成功用于听力障碍的基因治疗领域，Maeda等利用特异性siRNAs成功抑制了小鼠gjb2基因的表达，避免了进一步听力损失。针对tmc1小鼠和Beethoven小鼠的特异性miRNA，可延缓治疗小鼠进行性听力下降的表型。总之，基于RNAi在显性遗传性听力障碍的防治中具有令人鼓舞的特异性和有效性，标志着将这种方法向临床的转换迈出了重要的一步。
4.3 基因编辑（gene editing）
基因编辑是生物治疗的新技术，目前应用较多的基因工程酶有锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）、转录激活因子样效应核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）、簇状规则间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）和CRISPR相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）。在听觉研究中，基因编辑主要用于单核苷酸突变引起的显性遗传性听力障碍的基因治疗。Gao等首次证明了RISPR/Cas9治疗遗传性听力障碍的巨大潜力，针对tmc1小鼠的Cas9 gRNA脂质体复合物成功延缓了其听力损失的进展。最新研究发现，AAV介导的SaCas9-KKH-gRNA（AAV-mediated SaCas9-KKH-gRNA）可预防tmc1Bth / WT小鼠的听力下降。这些研究显示出遗传性听力障碍基因治疗的多种可能，随着这些方法的广泛使用和深入研究，正在革新听力障碍的基因治疗方法。
五、小结与展望
尽管听力障碍的基因治疗目前尚处于动物实验阶段，但系列动物模型的成功尝试为我们展示了遗传性听力障碍基因治疗的广阔前景，听力障碍动物模型的建立仍面临巨大的挑战。随着临床前研究和临床研究的深入，转化医学的进步使听力障碍的临床基因治疗呼之欲出。人类遗传性听力障碍涉及数百种不同的基因和临床表型，应依据致聋基因、靶细胞、致病机理等选择对应的基因治疗方法。尽管目前听力障碍的基因治疗仍面临诸多挑战，但随着科学技术的进步，相信听力障碍的临床治疗将不会太遥远。返回搜狐，查看更多
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