基于生物物理方法进行蛋白与分子间的亲和力检测一般需要高质量和纯度好的蛋白。然而一些蛋白很难纯化，如膜蛋白等，还有一些蛋白因为不稳定/丰度低/难纯化等问题，无法得到高质量和纯度好的蛋白开展体外分子互作实验。但是，利用免纯化微量热泳动 (Microscale Thermophoresis, MST) 技术，对于难以纯化的蛋白可以构建 GFP 等荧光融合蛋白，采用细胞裂解液直接进行 MST 实验，从而检测蛋白与分子间相互作用。如图1所示：
图1 MST 技术-蛋白免纯化互作亲和力检测
此外，蛋白在纯化过程中其构象可能发生改变，所获得的药物-靶标相互作用信息不能反映活细胞内的真实情况。而且很多蛋白很难重组表达纯化，进而限制了利用生物物理分子互作技术鉴定化合物和蛋白的相互作用。这时，也可以采用细胞热迁移技术 (cell thermal shift assay, CETSA) 在没有纯化靶蛋白的情况下开展蛋白和化合物相互作用研究 (图2)。
图2 CETSA 技术-蛋白免纯化互作研究
案例一 CETSA、分子对接、MST 在蛋白与小分子互作检测中的应用
过氧化物还原酶 (Peroxiredoxins, PRDXs) 是一类过氧化物酶蛋白家族。人类过氧化物酶蛋白家族含有6个成员 (PRDX1-6)，参与清除细胞内过量活性氧 (ROS)，从而维持细胞内 ROS 水平的平衡。2023年，上海中医药大学交叉科学研究院张卫东和刘三宏团队在期刊《Cell Chemical Biology》上发表了 “Ainsliadimer A induces ROS-mediated apoptosis in colorectal cancer cells via directly targeting peroxiredoxin 1 and 2” 的研究论文。该研究发现中药小分子 Ainsliadimer A (AIN) 通过直接与 PRDX1、PRDX2 蛋白结合，诱导 ROS 介导的细胞凋亡，进而发挥抗结直肠癌作用[1]。
Ainsliadimer A (AIN) 是从大头兔耳风中提取得到一种新的倍半萜内酯二聚体。作者结合多种策略 (CMAP、DARTS和TPP) 分析预测 PRDX1、PRDX2 可能是 AIN 抗肿瘤靶点。为了鉴定直接与小分子 AIN 结合的靶蛋白，作者采用细胞热迁移技术 (CETSA) 发现 AIN 可以在较高的温度下维持 PRDX1、PRDX2 蛋白的稳定性 (图3)。实验时，作者用液氮裂解 MCF-7 细胞，随后对细胞裂解液样本进行离心，收集上清液并等体积分装成50 μL/管，再将等分的上清液与 AIN (100 μM)、溶剂对照 (DMSO) 分别都进行孵育 (1 min或者60 min)，随后将样品在不同温度下加热 3分钟，冰上冷却3分钟，再进行离心，取上清后进行免疫印迹分析 (Western blotting )。
结果发现：当孵育1 min时，与溶剂对照组(DMSO)相比较，加药组在60℃-64℃和68℃-74℃温度范围内，小分子 AIN 显著增加了 PRDX1 和 PRDX2 的表达量 (图3A，3B，3C，3D)，这表明 AIN 可以在相对较高温度下，维持 PRDX1 和 PRDX2 蛋白的热稳定性。
图3 CETSA 技术验证 PRDX1、PRDX2 是小分子 AIN 的直接作用靶点(AIN与细胞裂解液孵育1min)
此外，当药物与细胞裂解液孵育时间为60 min时，与溶剂对照组 (DMSO) 相比较，加药组在60℃-64℃和68℃-74℃温度范围内，小分子 AIN 显著增加了 PRDX1 和 PRDX2 的表达量 (图4A，4B，4C，4D)，这和孵育1 min时间的结果一致。这表明小分子 AIN与 PRDX1、PRDX2 具有直接相互作用。
图4 CETSA技术验证PRDX1、PRDX2是小分子AIN的直接作用靶点(AIN与细胞裂解液孵育60min)
为了进一步验证上述结果，作者采用免纯化微量热泳动 (MST) 技术检测 AIN 与重组人 PRDX1 蛋白、AIN 与重组人 PRDX2 蛋白的亲和力，结果发现：AIN 与 PRDX1、AIN 与 PRDX2 蛋白亲和力较高，其 Kd 值分别为1.66和9.35 μM，同时也证明了 AIN 与 PRDX1 的结合更加稳定(图5A、5B)。
图5 MST 技术检测 AIN 分别与 PRDX1、PRDX2 蛋白的亲和力
AIN 含有α，β-不饱和结构。PRDX1 含有4个半胱氨酸 (Cys52、Cys71、Cys83和Cys173)，PRDX2 含有3个半胱氨酸 (Cys51、Cys70和Cys172)，作者基于分子对接和计算模拟发现：PRDX1 蛋白的 Cys173 位点通过与 AIN 的 Michael 受体羰基之间形成了稳定的氢键。此外，PRDX1 (Cys52、Cys71、Cys83) 和 PRDX2 (Cys51、Cys70、Cys172) 位点与 AIN 的 Michael 受体羰基也形成了稳定的氢键(图6)。
图6 分子对接
为了判断 AIN 与 PRDX1、PRDX2 的结合位点。作者将野生型的 GFP-PRDX1 过表达质粒、野生型的 GFP-PRDX2 过表达质粒、突变型的 GFP-PRDX1 (四种不同氨基酸突变位点：Cys52、Cys71、Cys83和Cys173)、突变型的 GFP-PRDX2 (三种不同氨基酸突变位点：Cys51、Cys70和Cys172) 过表达质粒分别转染至 293T 细胞中，培养48h后，将细胞进行裂解，离心后取上清。以含有 GFP 的融合蛋白作为荧光信号源，直接利用细胞裂解液体进行微量热泳动 (MST) 检测。结果发现：与野生型 PRDX1 相比较，当 Cys52、Cys71 或 Cys83 位点突变为丙氨酸，对 AIN 和突变体 PRDX1 的亲和力 Kd 值影响较小；而将 Cys173 发生突变时，突变体 PRDX1 不与 AIN 发生结合 (图7A)。另外，当 Cys51、Cys70 位点发生突变时，与野生型的 PRDX2 相比较，AIN 和突变体 PRDX2 的亲和力几乎不发生改变；而当 Cys172 位点发生突变时，突变体 PRDX2 不与 AIN 发生结合 (图7B)。上述结果表明：AIN 与 PRDX1 的氨基酸 Cys173 位点结合，与 PRDX2 的氨基酸 Cys172 位点结合。
图7免纯化MST技术检测野生型(PRDX1、PRDX2)、突变型的(PRDX1、PRDX2)分别与小分子AIN的亲和力
Cellular thermal shift assay (CETSA)
The CETSA experiment was carried out as described previously. Briefly, MCF-7 cells were lysed using liquid nitrogen, cell lysate samples were subjected to centrifugation, and the supernatant was collected. Aliquots were incubated with AIN (100 μM) or solvent control (DMSO) for 1 minute or 1 h at room temperature. Samples were divided in a volume of 50 μl/tube and heated at a range of temperatures for 3 min, cooled for 3 min at room temperature, and kept on ice. And in cell CETSA experiment of PRDX1/2 with short treatment time (20 minutes). All samples were subjected to centrifugation, and the supernatant (soluble fractions) was analyzed by Western blotting.
Microscale thermophoresis (MST)
The MST measurements for binding of AIN to PRDX1 and PRDX2 were performed as described previously. Briefly, 5 μl recombinant human PRDX1 and PRDX2 (Sino Biological, China) labeling the protein NHS-RED dye was mixed with 5 μl AIN at different concentrations. Then, the samples were incubated for 1 h at room temperature and analyzed by a MonolithTM NT.115 MST device (NanoTemper, Germany).
For the combination of AIN with wild-type and mutant PRDX1 and PRDX2, we expressed the GFP-carrying plasmid in 293T cells and obtained cell lysates after 48 hours. Using nanoblue excitation, the LED light was adjusted to 40% excitation power, and MST power was set to medium. The software was used in Expert mode to allow thermophoresis and fluorescence detection for 30 s. The rest of the operations are as described above.
案例二 MST 和 CETSA 在抗肿瘤作用机制研究中的应用
2022年北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室屠鹏飞与曾克武在国际学术期刊 eBioMedicine 上合作发表了题为“Atypical E3 ligase ZFP91 promotes small-molecule-induced E2F2 transcription factor degradation for cancer therapy”的研究论文，深入阐明了中药蟾酥主要活性成分蟾毒灵 (bufalin) 以天然分子胶水方式促进转录因子 E2F2 降解，进而发挥抗肿瘤的独特分子机制[2]。
作者前期实验发现 E2F2 为蟾毒灵 (bufalin) 的作用靶点，接下来，作者又通过小分子 Pull-down实验进一步证实了上述结论 (图8A)。此外，作者还采用微量热泳动 (MST) 实验证明 bufalin 与 E2F2 发生结合，实验时，作者将 pcDNA3.1(+)-His-E2F2 质粒瞬染至 293T 细胞中进行培养一段时间后，用 NP40 buffer 对细胞进行裂解，离心后取上清。采用试剂盒 (Monolith His-Tag Labelling Kit RED-tris-NTA 2nd Generation) 对裂解后的上清液进行荧光标记，与蟾毒灵共孵育后上样检测，测得蟾毒灵与 E2F2 的亲和力 Kd 值为3.15±1.43 μM (图8B)。
图8 小分子 Pull-down 技术和 MST 技术验证 E2F2 为蟾毒灵 (bufalin ) 的作用靶点
后续作者为了深入研究蟾毒灵促进 E2F2 与 ZFP91 相互作用的机制，推测蟾毒灵可能作为分子胶稳定它们的结合。作者采用 MST 技术发现蟾毒灵能与 ZFP91 发生相互作用，实验时，作者将 pEGFP-N1-ZFP91 质粒瞬染至 293T 细胞中进行培养一段时间后，用 NP40 buffer 对细胞进行裂解，离心后取上清，以含有 GFP 的融合蛋白作为荧光信号源，将上清液与蟾毒灵共孵育后上样检测，测得蟾毒灵与 ZFP91 的亲和力 Kd 为462 ± 146 nM (图9A)。此外，作者通过LC-MS/MS 等技术手段分析发现：349位半胱氨酸 (Cys349) 是蟾毒灵在 ZEP91 上的共价结合位点。
小分子蟾毒灵由两部分组成：结构 A (红色)和 B(蓝色)(图9E)。为了探索蟾毒灵的结构与 ZFP91 的结合关系，作者采用微量热泳动技术 (MST) 发现 α-Pyr (蟾毒灵结构B的类似物) 直接与 ZFP91 蛋白结合，且亲和力 Kd 为900 ± 322 nM，表明蟾毒灵的结构B是与 ZFP91 结合的关键结构 (图9C)。但是将氨基酸 Cys349 位点进行突变后，α-Pyr (蟾毒灵结构B的类似物) 不与突变体 ZFP91结合(图9D)，表明氨基酸 Cys349 位点在 α-Pyr 与 ZFP91 的结合中起着关键作用。
此外，作者还采用小分子 Pull-Down 实验发现 DHA (蟾毒灵结构 A 的类似物) 抑制了生物素-蟾毒灵与 E2F2 的结合，并且 α-Pyr (蟾毒灵结构 B 的类似物) 显著抑制了生物素-蟾毒灵与 ZFP91 的结合 (图9F）。
同时，作者还采用 CETSA 技术进一步证明 α-Pyr (蟾毒灵的结构 B 类似物) 提高了 ZFP91 蛋白的热稳定性 (图9B)。上述结果表明表明蟾毒灵的结构 A 主要与 E2F2 结合，结构 B 主要与 ZFP91 相互作用。这些结果为蟾毒灵可以作为分子胶介导 E2F2-ZFP91 复合物的形成，进一步促进 E2F2 的泛素化和降解提供了有力证据。
图9 蟾毒灵与 ZFP91、E2F2 互作机制研究
Pull-down assay
Cells were transfected with or without HA-E2F2, HAE2F2 (1–310), HA-E2F2 (125–310), HA-E2F2 (125–438) plasmid DNA. After treatments, cells were washed with PBS and lysed for 1 h in the buffer (Tris–HCl at pH 8.0 12 mM; Glycerol 10%; NaCl 137 mM; EDTA 1 mM) with protease inhibitor cocktail (Roche) in the presence of 1% NP40. Cell lysates were then spun at 12,000×g for 10 min at 4 ℃. Biotin-bufalin was coupled with streptavidin magnetic beads (Thermo) for 2 h at room temperature. 500 μg of cell lysate at 1 mg/mL was then used to incubate with the vehicle and bufalin-coupled beads in the absence or presence of bufalin (or α-pyrone, androsterone) cell lysates overnight at 4 ℃. Agarose was then spun and washed for 6 times. Binding proteins were eluted by 2 × SDS-PAGE loading buffer and detected by western blotting.
Cellular thermal shift assay (CETSA)
Cellular thermal shift assay was conducted as described previously. Briefly, Cells were treated with DMSO or 2 μM bufalin for 2 h, and then cells were collected and resuspended in PBS. Each aliquot were heated at indicated temperatures for 3 min on PCR instrument (BioRad, CA, USA) and frozen twice in liquid nitrogen. The samples were centrifuged and the supernatants were subjected to immunoblotting analysis.
Microscale thermophoresis analysis
The binding affinity of bufalin with E2F2 and ZFP91 were measured by microscale thermophoresis (MST). pcDNA3.1(+)-His-E2F2 and pEGFP-N1-ZFP91 were transiently transfected into HEK293T cells to express E2F2-His and ZFP91-GFP proteins. The cells were collected and then lysed in NP40 buffer. The His-tagged E2F2 was labelled with the Monolith His-Tag Labelling Kit RED-tris-NTA 2nd Generation (NanoTemper Technologies). Serially diluted bufalin compounds, with concentrations of 500 μM to 15 nM, were mixed with cell lysis solutions containing labelled E2F2, ZFP-GFP and GFP at room temperature and then loaded into Monolith standard-treated capillaries. Binding was measured by monitoring the samples at LED/excitation power of 20% and MST power of 40% on a Monolith NT.115 instrument (Nano Temper Technologies). The Kd values were determined using the MO. Affinity Analysis software (Nano Temper Technologies).
参考文献
[1] Lv, Chao, et al. "Ainsliadimer A induces ROS-mediated apoptosis in colorectal cancer cells via directly targeting peroxiredoxin 1 and 2." Cell Chemical Biology 30.3 (2023): 295-307.
[2] Liu, Ting-Ting, et al. "Atypical E3 ligase ZFP91 promotes small-molecule-induced E2F2 transcription factor degradation for cancer therapy." EBioMedicine 86 (2022).返回搜狐，查看更多
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