题目：单细胞和Bulk-RNA测序揭示了与脑海绵状血管畸形中铜凋亡相关的免疫浸润景观
英文名：Single-cell and bulk RNA-seq unveils the immune infiltration landscape associated with cuproptosis in cerebral cavernous malformations
杂志：Biomarker Research
影响因子：9.5
发表时间：2024年6月
研究背景：脑海绵畸形（CCMs）是一种先天性神经血管畸形，以散发性或家族性形式发生于青壮年。其发病机制和最佳治疗方法仍不清楚。铜通过引发细胞增殖、血管生成和代谢，参与了癌症的发生和发展。本研究旨在探讨铜死亡的分子特征，铜死亡是一种新发现的细胞死亡类型，与CCMs的发展有关。
研究思路：对15个CCM样本和6个对照样本Bulk-RNA数据进行了分析，并根据铜死亡相关基因（CRGs）的表达水平进行了一致性聚类，将CCM样本聚类为两个亚型。然后识别了亚型之间的差异表达基因和免疫浸润。使用包括LASSO和随机森林在内的机器学习算法，筛选出与铜凋亡相关的CCM的枢纽基因。此外，通过通路富集和相关性分析，探索了枢纽基因的功能以及它们与CCM免疫表型的关联。然后使用外部数据集进行验证。最后，利用单细胞RNA-seq数据集上的Cellchat算法，我们探索了这些枢纽基因在CCM细胞间通讯中的潜在机制。
图1
研究结果：
1、铜死亡相关基因（CRGs）的表达和脑海绵畸形(CCMs)中免疫浸润分析
分析了21名患者的表达谱数据，其中包括6名对照组患者和15名CCMs组患者（图2A）共有2963个DEGs，1169个基因上调，1794个基因下调（图2B）。GO富集分析发现，上调基因主要富集在与免疫和血管生成相关的GO项中（图2C）。CRGs是来源以前发表的一篇文章，作者进一步研究CRGs在CCMs差异基因中的表达模式，结果表明，CDKN2A、GLS、PDHA1和PDHB这四个CRGs在对照组和CCMs组之间表现出明显的表达差异（图2D-F）。FDX1和LIAS在CCMs中的表达有所增加，但没有明显差异（图2E、F）。鉴于CCMs中上调的DEGs主要富集在CCMs的免疫调节中（图2G）。CIBERSORT免疫浸润表明CCMs中的免疫细胞明显增多，包括巨噬细胞、树突状细胞（DC）、B细胞和T细胞（图2H）。对CRGs与免疫细胞之间关系的分析表明，大多数CRGs与CCR（C-C趋化因子接收器）、T细胞协同刺激、APC（抗原呈递细胞）协同刺激、DCs和Tfh（T滤泡辅助细胞）呈正相关。在相反，它们与APC协同抑制、副炎、Treg（调节性T细胞）、IIFN型反应、TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）、HLA（人类白细胞抗原）和大吞噬细胞（图 2I）。
图2
2、基于CRGs表达的CCM聚类分析、功能富集分析
基于共识聚类方法以及筛选的差异CRGs来研究CCMs的铜死亡模式。分析结果显示，在k=2时，两个样本群集之间的区别更加明显，从而建立了两个不同的群集（图3A-F）。火山图被绘制出来以展示两个群集之间的差异表达基因（DEGs）分布，当群集1与群集2比较时，包括281个上调基因和266个下调基因（图3G）。GO富集分析显示，DEGs主要富集在免疫调节、血管发育和突触（图3H）。群集内CRGs的表达，并确定了七个表现出差异表达的基因（图3I）。
图3
3、与不同亚型CCM相关的枢纽基因
作者进一步从簇1与簇2、对照组与CCMs中精心挑选了273个交叉DEGs，用于筛选与CRGs聚类的不同亚型CCMs相关的特征中枢基因（图4A）。在筛选过程中采用了LASSO回归和随机森林算法。如图4所示，通过LASSO回归分析确定了14个与CCMs相关的特征基因。随机森林算法选择了一组10个特征基因（图4D）。然后将这些基因与LASSO回归算法得到的特征基因相交，最终得到三个重叠基因，即PFDN4、CEMIP和BTBD10（图4E）。这些基因在接下来的研究中将作为中心基因进行研究。BTBD10和PFDN4在聚类1中表达量很高、而CEMIP在第2组中高表达。此外，这三个基因在CCMs中都显著过表达（图4F-G）。此外，利用GeneCards数据库确定了与CCM相关的致病基因（图4H-I)。
图4
4、CCMs亚型的免疫渗透特征
免疫微环境主要由免疫细胞、细胞外基质、各种生长和炎症因子以及独特的理化特征组成。这些因素对CMMs的发育或出血有重要影响。利用ssGSEA进行了初步分析，通过研究两个集群与免疫炎症侵润之间的相关性，探讨了导致CCMs进展的潜在分子机制。在多种免疫细胞中观察到了统计差异，包括活化的树突状细胞（aDCs）、B细胞、检查点、DCs、促炎细胞、巨噬细胞、神经滋养细胞、浆细胞状树突状细胞（pDCs）、T细胞共同抑制、T辅助细胞、TIL和IIIFN型应答组群1和组群2之间，组群2的免疫炎症水平明显高于组群1（图5A）。然后用CIBERSORT算法验证了ssGSEA的结果，得出了一致的结果（图5A）。值得注意的是，巨噬细胞，尤其是M0和M2型巨噬细胞，在CIBERSORT评估的所有免疫细胞中占很大比例（图5B-C）。第1组的中枢基因BTBD10和PFDN4与大多数免疫细胞（包括巨噬细胞和B细胞）呈显著负相关（图5D-F）。相反，第2组的中心基因CEMIP与大多数免疫细胞呈显著正相关（图5D-E）。
图5
5、CCMs亚型中免疫系统相互作用的差异分析
从TISIDB数据库中提取了各种免疫因子，并分析了不同免疫因子群的组间差异，包括免疫相关趋化因子、免疫抑制因子和免疫刺激因子。结果显示，趋化因子（C-X-C矩阵）配体9（CXCL9）、趋化因子（C-C矩阵）配体22（CCL22）、趋化因子（C-X-C矩阵）配体12（CXCL12）以及免疫抑制因子显著上调、以及免疫抑制因子，包括集群2中的集落刺激因子1受体（CSF1R）、IL10、TGFB1、TGFBR1、CD274和程序性细胞死亡1配体2（PDCD1LG2）。
6、中枢基因的信号通路富集
分析了三个枢纽基因所富集的信号通路，以研究它们影响CCMs进展的潜在分子机制。如图6所示，TeGSVA结果表明，BTBD10在高表达时主要激活mTORC1、脂肪酸代谢、刺猬和PI3K-ATK-MTOR信号转导等信号通路。6A、B表明，CEMIP的高表达主要富集于IL6/JAK/STAT3、血管生成、通过 NFκB的TNFA信号和炎症反应信号通路。同时，PFDN4的表达在胆汁酸代谢、KRAS信号转导和脂肪酸代谢中显著富集。GSEA分析结果表明，BTBD10在趋化因子、NOD样受体和Toll样受体信号通路中富集（图6D）。CEMIP在cAMP信号通路、谷氨酸能突触和逆行内大麻素信号通路中富集（图6E）。PFDN4富集于钙信号通路、cAMP信号通路和神经活性配体-受体相互作用（图6F）。这些发现表明，枢纽基因可通过调节血管内皮生长、炎症反应、线粒体能量代谢和细胞周期，对CCMs的进展产生重要影响。
图6
7、人内皮细胞中枢纽基因的验证
考虑到CCMs与血管生成的相关性，我们选择了包含ccm内皮细胞的RNA-seq数据集。以验证枢纽基因在人内皮细胞中的表达和功能（图7A）。在CCMs_ECs和Control_ECs的比较中，共发现了149个上调的DEGs和9,726个下调的DEGs（图7B）。发现上调的DEGs富集在与免疫调节和血管发育相关的GO术语中，与初步分析的结果一致（图2C）。在CRGs的表达方面，CDKN2A、FDX1和LIAS在CCMs_ECs组中上调，而GLS、MTF1和PDHB在Control_ECs组中上调（图7D）。因此，CCMs_ECs组似乎表现出更多与杯突变相关的特征。同时，我们发现枢纽基因BTBD10、PFDN4和CEMIP在CCMs_ECs中显著上调（图7E）。进一步对CCMs_ECs组的枢纽基因和CRGs进行了相关性分析。结果显示，在与CRGs的关系分析中，BTBD10的表达与PFDN4一致，与FDX1、LIAS和DLAT呈显著正相关，与GLS和PDHA1呈显著负相关（图7F）。值得一提的是，CEMIP与BTBD10和PFDN4的相关结果恰恰相反，与FDX1、LIAS和DLAT呈显著负相关，与GLS和PDHA1呈显著正相关。这些结果也与原发分析中基于CRGs表达的聚类结果高度一致（图3I）。
免疫浸润分析结果表明，CCMs_ECs组的免疫细胞浸润较高（图7G）。与CCMs大体标本的初步分析结果一致（图2H）。中枢基因与免疫细胞的相关性分析表明，BTBD10和PFDN4与大多数免疫细胞呈负相关，而CEMIP与免疫细胞呈正相关（图7H-J）。有趣的是，BTBD10和PFDN4与M2巨噬细胞呈正相关，而与M1巨噬细胞呈负相关（图7H-J）。而CEMIP则显示出相反的相关模式（图7I）。
图7
8、在HS队列中验证中心基因
为了进一步确定这三个枢纽基因在CCMs中的实际表达情况，我们在HS队列收集的CCMs样本中进行了免疫荧光共定位并评估了蛋白表达水平（图8A）。与对照组相比，CCMs组中BTBD10、CEMIP和PFDN4的水平显著升高，这表明这些枢纽基因在CCMs组织中的功能表达（图8B-E）。
图8
9、在单细胞水平验证枢纽基因
从scRNA-seq数据集（GSE155788）中共获得四个样本（两个正常样本和两个CCMs样本）进行分析。这些细胞被分为五种主要细胞类型，包括红细胞、MΦ/MG、神经胶质细胞、内皮细胞和神经细胞（图9A）。根据已知标记，选择内皮细胞细分细胞亚群，共鉴定出七个内皮细胞群，包括动脉、动脉毛细血管、静脉毛细血管、静脉毛细血管（Mki67+）、静脉、顶端细胞和顶端细胞（Mki67+）（图9B）。随后的共表达分析表明，群组1中的Btbd10和Pfdn4在CCMs的多个EC中重叠（图9C）。证明了它们在细胞水平的高水平共表达。群组2的Cemip在CCMs细胞群中的总体表达水平相对较低。亚组分析显示，Btbd10和Pfdn4在尖端细胞（Mki67+）中的表达量较高（图9D）。Btbd10在动脉中高表达，而Pfdn4在静脉、静脉毛细血管（Mki67+）和动脉毛细血管中高表达。Cemip在静脉毛细血管（Mki67+）、顶端细胞和动脉毛细血管中高表达，尤其是在静脉系统中。随后，对CCMs不同细胞亚群中的中枢基因和CRGs进行了相关性分析，结果表明这三个中枢基因和CRGs之间的关系是异质性的（图9E）。
图9
10、Btbd10通过M2巨噬细胞和尖端细胞（Mki67+）之间的细胞通讯调节CCM的潜在铜死亡机制
接下来的目标是研究Btbd10在内皮细胞中的高表达是否与CCMs中细胞间通讯的改变相吻合。为此，使用CellChat分析scRNA-seq数据中的细胞间通讯。（图10A）。MΦ/MG与大多数其他细胞之间的细胞-细胞相互作用强度显著增强，尤其是MΦ/MG与内皮细胞之间，这与我们在大量RNA-seq数据集中的观察结果一致（图2H）。随后，将MΦ/MG分成两个亚群，即M1和M2，以探讨它们与CCMs样本中高表达枢纽基因的内皮之间的相互作用（图10B）。M2MΦ/MG与Btbd10+内皮细胞和Pfdn4+内皮细胞之间的相互作用强度强于其他细胞，表明这两个内皮亚群可能在与M2MΦ/MG的相互作用中发挥主要功能作用。这一发现与作者在大量RNA-seq数据中的分析结果一致（图5D-F）。然而，M2MΦ/MG与Cemip+与所有内皮细胞相比，Cemip+内皮细胞与M2MΦ/MG之间的相互作用较弱，这表明Cemip+内皮细胞与M2MΦ/MG之间的相互作用可能不是主要的功能性相互作用。具有高表达中枢基因的内皮细胞和MΦ/MG之间有很大可能主要通过多养蛋白（Ptn）与核蛋白（Ncl）的结合以及fbronectin（Fn1）与整合素alpha4（Itga4）和整合素a1（Itgb1）的结合进行交流（图10C）。考虑到Bdbt10与几个内皮亚群的CRGs之间的正相关性（图9），Bdbt10与内皮亚群的CRGs之间的正相关性（图10E）。我们接着探讨了Btbd10+内皮细胞与MΦ/MG之间显著的相互作用路径（图10D）。在MΦ/MG和Btbd10+内皮细胞之间的相应连接对中，相应信号通路的受体和配体的表达也有所增加（图10D）。由于Btbd10在顶端细胞（Mki67+）中的高表达量，Btbd10在顶端细胞（Mki67+）中的高表达量（图10D）。作者试图在内皮细胞的相关细胞亚群中探索并验证Btbd10与铜死亡- Fdx1之间的相关性。随后，分析了Btbd10与Fdx1之间的关系（图11A）。结果显示，在CCMs样本的尖端细胞（Mki67+）中，Btbd10与Fdx1呈显著正相关，而在对照组中则无明显相关性。进一步的共定位结果也暗示了Btbd10和Fdx1在尖端细胞（Mki67+）群体中的共表达（图11B）。M2MΦ/MG，有明显的相互作用强度（图11C）。同时，与顶端细胞相比在Btbd10低表达的尖端细胞（Mki67+）与M2MΦ/MG之间，观察到相互作用强度显著增加（图 11D）。Bdbt10高表达或低表达的M2MΦ/MG和尖端细胞（Mki67+）之间的配体-受体途径，发现它们主要通过Esam（上皮细胞-裂隙粘附分子）-Esam、Col4a1-(Itga1+Itgb1)（胶原Ⅳ型α1链-（与integ-rina1相互作用）+Itgb1）和Ptn-Ncl配体途径相互作用（图11E）。M2MΦ/MG与尖端细胞（Mki67+Btbd10-）之间的相互作用主要通过Col4a1-(Itga1+Itgb1)和Ptb-Ncl进行（图11F）。这些结果表明，M2MΦ/MG可能通过上述配体-受体途径与顶端细胞（Mki67+）相互作用，并驱动顶端细胞（Mki67+）的铜死亡，从而对CCMs的进展产生潜在影响。
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