动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种常见的慢性血管疾病，为多种心脑血管疾病的发病基础。根据世界卫生组织数据显示，心血管疾病已经成为全球死亡的首要原因之一，每年约造成1 700多万人死亡[1-2]。研究表明，AS是一种慢性、进行性动脉疾病，炎症反应和脂质代谢障碍是其发病的主要原因[3]。肝脏是胆固醇合成和代谢的主要器官，能通过调节胆固醇水平而维持血脂稳态[4]。而肝脏内过多脂肪的积累也将诱发肝脏的炎症反应[5]。肝脏产生的炎症因子也是诱发和加重AS的主要因素[6]。因此，改善肝脏的脂代谢、抑制肝脏的炎症反应能抑制AS的发生和发展。
25-羟基胆固醇（25-hydroxycholesterol，25-HC）是胆固醇在胆固醇25羟化酶（cholesterol 25 hydroxylase，CH25H）作用下的氧化衍生产物[7]，由巨噬细胞Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）激活而产生和分泌[8]。研究发现，AS斑块中活化的巨噬细胞可产生25-HC并抑制斑块内平滑肌细胞迁移，进一步增加斑块的不稳定性[9]。而25-HC也能促进巨噬细胞泡沫化，导致脂质条纹增粗或动脉斑块进一步扩大[10]。此外，25-HC不仅能增强荷脂巨噬细胞的炎症反应，刺激TLR4信号通路并增强细胞凋亡敏感性[9]，还能通过抑制内皮型一氧化氮合酶解偶联以及诱导内皮细胞凋亡进而损害内皮功能，加速AS的发展[11]。因此，25-HC和TLR4通路在AS诱发的脂代谢紊乱和炎症反应中发挥着重要的作用[12]。
AS在中医中虽无明确病名，但据其症状体征，可属于“脉痹”“心悸”“中风”等病症范畴[13]。其病机在于人体气血阴阳不足，出现痰、瘀、毒等病理产物，充斥脉络，聚而难消。痰浊、瘀血、毒邪胶着难解，损及脉管，进而发病[14]。大蒜别名胡蒜、葫、独蒜，始载于陶弘景《名医别录》，为天然药食同源药物，其味辛性温，《本草纲目》记载：“其气熏烈，能通五脏，达诸窍……血逆心痛，生蒜捣汁，服二升即愈”[15]。《本草经疏》中亦记载其“辛温能辟恶散邪……辛温走窜，无处不到，故主归五脏”[16]。提示大蒜辛温走窜之力较强，能达全身诸窍。此外，《本草拾遗》中亦有云：“大蒜宣通温补，无以加之”[17]，提示大蒜能补阳扶阳，使阳气运行宣畅。由此可见，大蒜能温中散寒通络、活血化瘀、消除瘀滞，具有治疗AS的作用。
大蒜素是大蒜的主要活性成分之一，具有抗炎、杀菌、预防心脑血管疾病、抗肿瘤等生物活性，且其不良反应少，临床使用安全[18-20]。研究表明，大蒜素能有效降低糖尿病ApoE−/−小鼠血脂、血糖、同型半胱氨酸水平，抑制AS不稳定斑块的破裂[21]。此外，大蒜素能通过肠道微生物群减少三甲胺-N-氧化物的产生进而抑制AS的发展[22]。大蒜素还能促进核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）活化并抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）对血管内皮细胞的损伤[23]，抑制氧化低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞凋亡，进而改善内皮细胞功能[24]，但是，大蒜素抑制AS的发生和发展是否与调节肝脏脂代谢紊乱及炎症反应相关尚未见相关报道。因此，本研究以高脂喂养的ApoE−/−小鼠为研究对象，探讨大蒜素对AS模型小鼠肝脏脂代谢紊乱和炎症反应的影响以及其可能的作用机制，以期为大蒜素防治AS提供科学依据。
1 材料
1.1 动物
1.2 药品与试剂
1.3 仪器
22331 Hamburg 型离心机（德国Eppendorf 公司）；RM2255 型轮转式切片机（德国Leica 公司）；BX53 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；Multiskan SkyHigh 全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；电泳、电转系统（美国Bio-Rad 公司）；Tanon 5200 系列凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）。
2 方法
2.1 动物分组、造模与给药
所有小鼠适应性喂养1周后，将24只ApoE−/−小鼠随机分为模型组、阿托伐他汀（2.6 mg/kg）组和大蒜素（20 mg/kg）[25-26]组，每组8只，给予高脂饲料喂养。另取8只C57BL/6N野生型小鼠作为对照组，给予普通饲料喂养。喂养8周后，各给药组ig以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制的相应药物（10 mL/kg），对照组和模型组ig等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，1次/d，连续给药9周。给药过程中每日监测小鼠进食量变化，每周称量1次小鼠体质量。
2.2 血清指标检测
给药结束后，小鼠禁食不禁水12 h ，腹腔麻醉后，取腹主动脉血，室温静置2 h ，4 ℃、3 000 r/min 离心10 min ，取上清。按照试剂盒说明书检测血清中TC 、TG 、HDL-C 、LDL-C 、25-HC 、IL-6 、IL-1β 、TNF-α 水平和AST 、ALT 、ALP 活性，并计算non-HDL-C 水平和AS 指数。
non-HDL-C水平＝TC水平－HDL-C水平
AS指数＝(TC水平－HDL-C水平)/HDL-C水平
2.3 油红O染色观察AS斑块形成
取各组小鼠主动脉，剥离其外周脂肪组织，并在预冷的生理盐水中清洗干净以去除血液及其他污物，用解剖剪沿血管壁小心将血管纵向剖开，放入4% 多聚甲醛固定24 h 后，用PBS 浸洗2 次。将血管浸入油红O 染液，于37 ℃染色60 min ，75% 乙醇分化，蒸馏水洗涤2 次。将染好的主动脉平铺于板上，拍照。采用Image Pro Plus 图像分析系统测量主动脉油红O 着色斑块面积及管腔内膜总面积，计算斑块面积相对百分比。
斑块面积相对百分比＝斑块总面积/内膜总面积
2.4 HE染色观察肝脏病理变化
小鼠取血后立即摘取肝脏，称定质量，计算肝脏指数。切下肝小叶后脱水、浸蜡、包埋、修蜡块、切片，将切片依次置入二甲苯I 、II 各15 min ，梯度乙醇复水，按照HE 染色试剂盒说明书进行染色、脱水、透明，中性树脂封片后拍照观察，并按照文献方法[27] ，由2 名实验人员（盲法）进行病理学评分。评分标准：肝细胞形态及肝细胞索排列整齐，无炎症细胞浸润等病理改变，为0 分；肝细胞索排列紊乱，偶见脂滴空泡，有轻微的炎性细胞浸润，为1 分；肝细胞有轻度肿胀，较多脂滴空泡或炎性细胞浸润，为2 分；肝窦消失，肝细胞重度肿胀，有大量脂滴空泡或炎性浸润，为3 分；肝细胞大面积空泡样病变并有炎性坏死，为4 分。
肝脏指数＝肝脏质量/体质量
2.5 肝组织TC、TG 和FC水平的检测
称取100 mg 肝组织，按照试剂盒说明书测定TC 、TG 和FC 水平。
2.6 Western blotting检测肝组织中CH25H和TLR4信号通路相关蛋白表达
称取100 mg 肝组织，加入裂解液提取蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。分别取50 μg 样品与上样缓冲液混合均匀，100 ℃加热7 min 使蛋白变性。蛋白样品经10% 十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，加入3% 牛血清白蛋白，室温封闭1 h ，分别加入CH25H （1 ∶1 000 ）、TLR4 （1 ∶3 000 ）、NF-κB （1 ∶3 000 ）、p-NF-κB （1 ∶1 000 ）、MyD88 （1 ∶3 000 ）、IL-1β （1 ∶3 000 ）和GAPDH （1 ∶5 000 ）抗体，4 ℃孵育过夜；次日，TBST 洗膜后，分别加入二抗（1 ∶12 000 ），室温孵育1 h ，使用ECL 发光液显色，采用凝胶成像仪拍照，利用Image J 软件对条带进行半定量分析。
2.7 统计学分析
利用GraphPad prism 10 软件对数据进行分析，结果以表示。方差齐则采用单因素方差分析，方差不齐时采用Welch’s t 检验。
3 结果
3.1 大蒜素对AS小鼠体质量、进食量、主动脉斑块面积及肝脏脂质沉积的影响
3.2 大蒜素对AS小鼠血脂代谢以及AS指数的影响
AS发生的主要危险因素包括血脂代谢的异常，除临床常见的TC、TG、LDL-C和HDL-C评价指标外，近年来，non-HDL-C逐渐作为独立危险因素，被认为是心血管事件的预测指标[28]。如图4所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、non-HDL-C水平和AS指数均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平和AS指数均显著降低（P＜0.05、0.01），大蒜素组小鼠血清中non-HDL-C 水平显著降低（P ＜0.01 ），表明大蒜素能改善AS 小鼠的血脂代谢。
3.3 大蒜素对AS小鼠肝脏指数、肝功能以及肝脏TC、TG 和FC水平的影响
如 图5所示，与对照组比较，模型组小鼠的肝脏指数以及血清肝功能指标（ALT、AST、ALP）均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠的肝脏指数和血清中ALT活性明显降低（P＜0.05、0.01），大蒜素组小鼠血清中AST和ALP活性显著降低（P＜0.01）；与阿托伐他汀组比较，大蒜素组小鼠血清肝功能指标均显著降低（P＜0.01）。
如图6 所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏中TC 、FC 和TG 水平均显著升高（P ＜0.01 ）；与模型组比较，各给药组小鼠肝脏中TC 、TG 水平均显著降低（P ＜0.01 ），大蒜素组小鼠肝脏中FC 水平显著降低（P ＜0.01 ）；与阿托伐他汀组比较，大蒜素组小鼠肝脏中FC 水平显著降低（P ＜0.01 ）。
3.4 大蒜素对AS小鼠血清中炎症因子和25-HC水平的影响
如图7 所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中炎症因子（IL-6 、TNF-α 、IL-1β ）和25-HC 水平显著升高（P ＜0.01 ）；与模型组比较，各给药组小鼠血清中炎症因子（TNF-α 、IL-6 和IL-1β ）水平均显著降低（P ＜0.05 、0.01 ），大蒜素组血清中25-HC 水平显著降低（P ＜0.01 ）；与阿托伐他汀组比较，大蒜素组小鼠血清中25-HC 水平显著降低（P ＜0.01 ）。表明大蒜素能抑制AS 小鼠的血清炎症反应。
3.5 大蒜素对AS小鼠肝组织CH25H和TLR4信号通路相关蛋白表达的影响
为进一步研究大蒜素对高脂喂养的ApoE−/−小鼠肝脏脂质积累和炎症的干预作用及机制，通过Western blotting检测了肝脏CH25H和TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关蛋白的表达。如图8所示，与对照组比较，
4 讨论
AS 的发生和发展与肝脏炎症反应和脂质代谢异常密切相关。ApoE 载脂蛋白是一种多态性蛋白，主要在肝脏中合成，可通过与LDL 受体和肝脏ApoE 受体结合，促进血液中乳糜微粒（chylomicron ，CM ）、LDL 和极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein ，VLDL ）的降解[29] 。敲除ApoE 基因 的小鼠由于体循环中TG无法被肝脏吸收而滞留血液中形成高脂血症，进而诱发AS[30]。ApoE−/−小鼠是目前研究AS应用最为广泛的小鼠，在正常饮食下，16周龄的ApoE−/−小鼠TC和LDL-C水平为野生型小鼠的数倍，同时伴有主动脉脂质的沉积[31]。而在高脂饲料喂养下，16 周龄的ApoE−/− 小鼠可见AS 中晚期病理表现[31] 。 因此，本研究采用高脂饲料喂养雄性ApoE−/−小鼠，建立小鼠AS模型。结果显示，大蒜素干预AS小鼠9周后，能显著抑制AS小鼠主动脉脂质斑块的沉积和肝脏脂肪变性，降低AS小鼠血清TC、TG、LDL-C水平和肝脏TC、TG、FC含量。文献报道也显示，大蒜素干预能显著降低糖尿病ApoE−/−小鼠血脂（TC、TG和LDL-C）水平[21]，能呈剂量相关性地减少主动脉脂质斑块的形成[25]，减轻高脂高胆固醇饮食诱导的肝脏脂肪变性[32]。临床实验也证明，大蒜素能降低高脂血症患者血脂水平[33-35]。以上结果表明，大蒜素能抑制AS 小鼠主动脉的脂质斑块沉积，改善血脂代谢和抑制肝脏的脂肪变性。
non-HDL-C 是指除HDL-C 以外的其他脂蛋白中含有胆固醇的总和，包括LDL-C 、VLDL-C 等。研究发现，除LDL-C 外，其他non-HDL-C 中的脂蛋白均可促进AS 的发生和发展[36] ，因此，与HDL-C 相比，non-HDL-C 被认为能更好地预测AS 发生和发展，是AS 的独立危险因素或预测因素，并逐渐受到临床关注[28] 。AS 指数能从AS 的危险因素non-HDL-C 和安全因素HDL-C 双方面衡量AS 的发生和发展[37] 。本研究发现，大蒜素能显著降低小鼠non-HDL-C 水平和AS 指数，具有抑制AS 发生和发展的作用。
AS 是一种慢性炎症性血管系统疾病，IL-6 、IL-1β 和TNF-α 是促进其发生和发展的重要炎性标志物[38] 。IL-6 是一种多效性细胞因子，能直接或间接通过加重炎症反应而促进AS 的发生和发展[39] 。IL-1β 是炎症瀑布链上游因子，由炎性小体产生[40] ，既可促进IL-6 和TNF-α 的生成以增强炎症反应，又可特异性促进AS 斑块形成[41] 。在AS 发展过程中，单核细胞和中性粒细胞产生的TNF-α 能诱发细胞凋亡和坏死，导致血管内皮细胞功能障碍，促进斑块的破裂[42] 。循环炎性因子水平的升高和血脂异常进一步导致肝功能损伤加重[43] 。本研究结果显示，大蒜素能降低AS 小鼠血清IL-6 、IL-1β 和TNF-α 的水平，能显著降低AS 小鼠肝功能（ALT 、AST 和ALP ）活性，同时抑制肝脏中炎症因子（IL-1β ）的表达。文献报道也表明，大蒜素能抑制ApoE−/− 糖尿病小鼠IL-6 的分泌[21] ，能降低LPS 刺激的RAW264.7 细胞中IL-1β 和IL-6 的表达[44] 。以上结果表明，大蒜素能抑制AS 小鼠的肝脏乃至全身的炎症反应，改善其肝功能。
CH25H是一种参与胆固醇代谢的酶，可催化产生25-HC进而调节炎症反应和脂质代谢[45]。研究表明，CH25H/25-HC不仅参与阿尔茨海默病、糖尿病肾病、癌症等发病过程[46-48]。而且也参与AS的发生和发展。巨噬细胞产生的25-HC在斑块中积累，能促进内皮细胞凋亡，抑制内皮细胞依赖性血管舒张，进而促进血管炎症反应和重塑[11]。25-HC还能通过活化转录因子4（activating tranion factor 4, ATF4）/ C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein, CHOP）信号通路以激活内质网应激和促进血管钙化，而血管钙化也是心血管疾病的一个常见重要危险因素[49]。研究表明，LPS激动TLR4后，能促进CH25H的表达[50]。而在AS斑块中，25-HC也能促进TLR4信号通路的激活[9]。LPS/TLR4信号可以激活MyD88，导致NF-κB的高表达，进而加剧炎症反应[51]。本研究发现，AS模型小鼠血清中25-HC水平明显升高，肝脏中CH25H蛋白表达量也显著增加，而大蒜素干预该模型小鼠9周后能显著降低血清25-HC和肝脏CH25H的水平。本研究也发现，大蒜素能显著降低小鼠肝脏中TLR4、MyD88、p-NF-κB、p-NF-κB/NF-κB的表达。提示大蒜素可能通过调节肝脏TLR4/MyD88/NF-κB通路进而抑制AS小鼠肝脏的炎症反应，从而发挥抗AS的作用。
综上，本研究发现大蒜的活性成分大蒜素能改善AS 小鼠脂代谢紊乱和炎症反应，抑制AS 小鼠的主动脉脂质斑块的形成，其作用机制可能与抑制肝脏25-HC 的生成以及抑制TLR4 炎症信号通路有关。本研究为大蒜素治疗AS 的临床应用提供一定的科学依据，同时也为防治AS 药物的研发提供了新的策略。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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