导读：表达嵌合抗原受体（CAR）的基因工程免疫细胞已成为癌症免疫治疗的热门。用mRNA编码的CAR武装免疫细胞代表了癌症及其他领域的新前沿。
2023年9月，深圳市人民医院李斌团队在Trends in Biotechnology（IF:14.3）上发表综述《Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology》，总结了基于mRNA的CAR免疫疗法的最新进展，及开发新一代活体药物方面的机遇和挑战。
周伯平和李斌两位老师是该文章的共同通讯作者。周伯平教授博士就读于中山医科大学（现中山大学），长期从事肝病研究，现任深圳市人民医院龙华分院院长。李斌老师是中国医学科学院&北京协和医学院博士，师从甄永苏院士。现任南方科技大学医学院临床副教授、硕士生导师，主要研究方向为mRNA药物递送、mRNA CAR疗法和mRNA基因编辑技术等。
01
嵌合抗原受体疗法与mRNA技术的碰撞
将CAR引入T细胞被证明是一种高效且特异性的免疫治疗策略。过去三十年里，基于CAR的疗法通过一系列迭代极大地改变了免疫医学的治疗格局。2017年，首个CAR-T细胞产品Tisagenlecleucel（Kymriah）被FDA批准用于急性淋巴细胞白血病，之后的5年里，又有7种针对血液肿瘤的CAR-T疗法获得批准，但其向实体瘤的临床转化仍受渗透性差、肿瘤异质性和免疫抑制微环境的阻碍，为克服上述问题，自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞等其他免疫细胞用于制备CAR分子（CAR-NK、CAR-M）。近年来，CAR疗法已应用于肿瘤学以外的其他免疫相关疾病，如自身免疫、慢性感染、心脏纤维化和衰老等。
图1基于mRNA的CAR技术的关键进展点
mRNA疗法最近成为关注的焦点，除mRNA疫苗外，其还在蛋白质替代疗法、再生医学、癌症免疫疗法和基因编辑领域得到探索。因简单、低成本和可接受的安全性，用编码CAR的mRNA改造免疫细胞为离体和体内快速大规模制造CAR武装细胞提供了一种替代策略，且无插入诱变的风险。截止2023年有超过10种基于mRNA的CAR疗法正进行临床评估。
图2 CAR-mRNA的构建、转移及翻译
02
利用mRNA技术释放免疫细胞的潜力
CAR-T细胞产品的离体制造过程通常包含T细胞分离、活化、T细胞工程、扩增和回输等流程，需数周至数月，治疗价格为35-50万美元/每次。在临床研究中，逆转录病毒和慢病毒载体等由于高转导率常用于将CAR基因体外转移到免疫细胞中，或通过将CAR基因靶向敲入特定位点来永久表达CAR。但由于长期基因表达及不必要的基因组整合风险，安全性问题日渐突出。
表1 制备CAR免疫细胞的病毒和非病毒方法的比较
利用体外转录（IVT）的mRNA编码CAR，经电穿孔或mRNA递送载体对免疫细胞进行编程，代表CAR疗法与mRNA技术的融合。基于mRNA的CAR疗法具下述优势：
（1）mRNA在胞质中合成蛋白质，无转基因整合的风险；
（2）mRNA可经体外转录，在体内快速合成任何目标蛋白；
（3）mRNA工程（mRNA修饰、非翻译区优化和密码子优化等）可有效降低免疫原性、增强稳定性和翻译能力；
（4）mRNA电穿孔和mRNA递送载体均可促进mRNA的内化及运输。
当前这些策略为基于mRNA的CAR疗法铺平了道路（图3）。
图3 CAR-mRNA的体外和体内T细胞工程研究
03
通过离体电穿孔生产基于mRNA的CAR细胞
电穿孔长期作为离体CAR-mRNA的转移方法，常通过优化电场、缓冲液等参数实现高性能电穿孔。
3.1 T细胞
最近研究表明，相较于病毒载体产生的CAR-T细胞，用等渗电穿孔缓冲液抑制人原代T细胞的特异性DNA感应通路可显著降低电穿孔诱导的毒性并产生更有效的CAR-T细胞。
3.2 NK细胞
NK细胞含多种激活受体，可通过天然或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性触发癌细胞的自发裂解。与CAR-T细胞疗法类似，CD19是CAR-NK细胞疗法最常见的治疗靶点。早期研究表明，与DNA电穿孔和慢病毒载体转导相比，抗CD19 CAR-mRNA电穿孔可产生高水平CAR＋ NK细胞，且CAR表达及活性可持续数天。
近年来，CD20、自然杀伤细胞2族成员D配体（NKG2DL）和B细胞成熟抗原（BCMA）已被用作电穿孔CAR-NK细胞疗法的目标靶点。对于用抗CD20 CAR-mRNA电穿孔的NK细胞，与组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合使用可增强其在小鼠中对利妥昔单抗敏感和耐药的伯基特淋巴瘤的抗肿瘤活性；对于NKG2DL和BCMA，共同递送编码趋化因子受体和编码CAR的mRNA（如趋化因子受体CXCR1 mRNA和抗NKG2DL CAR-mRNA；趋化因子受体CXCR4 mRNA和抗BCMA CAR-mRNA）或两种类型的CAR-mRNA（如抗CD19 CAR-mRNA和抗BMCA CAR-mRNA）在NK细胞上提供一种增强CAR-NK细胞疗效的新策略。
3.3 巨噬细胞
因巨噬细胞可浸润实体瘤组织并克服靶抗原异质性，CAR-M作为针对实体瘤的新型免疫治疗候选者。用INF-β引发抗HER2 CAR-mRNA电穿孔巨噬细胞诱导巨噬细胞向M1表型持续极化，并显著增强CAR表达的持久性，最终导致抗肿瘤功能增强和对免疫抑制因子的抵抗。
04
通过mRNA递送生产CAR细胞
上述电穿孔会导致大量细胞死亡，不适用于放大应用。基于生物材料的mRNA递送载体，如脂质纳米颗粒（LNP）、聚合物纳米颗粒和外泌体被研究用于CAR-mRNA递送载体。
4.1 LNP介导的体外CAR-mRNA递送
LNP是最先进的RNA递送平台，近年来开发出新型LNP将CAR-mRNA体外递送至免疫细胞。2020年，用封装CAR-mRNA的C14-4 LNP处理人原代T细胞，在体外产生与电穿孔法相当的CAR表达及癌症杀伤活性，但细胞毒性显著降低。另一项研究开发9322-O16B LNP和76-O17Se LNP两种制剂，分别将化学修饰CAR-mRNA递送至原代巨噬细胞和CD8＋T淋巴细胞。两种工程细胞均可在体外显著消除B淋巴瘤。证明了使用mRNA-LNP对免疫细胞进行体外工程改造的可行性。
4.2 其他生物材料介导的体外CAR-mRNA递送
电荷改变可释放转运蛋白（CART）和外泌体也可用于构建CAR-mRNA免疫细胞。CART BDK-O7:N7:A13是一种比电穿孔效率更高、细胞毒性更低的寡聚物，可用于递送编码抗人CD19/4-1BB/CD3ζ CAR的mRNA，并有效生成细胞毒性人CAR-NK细胞，而无需预先的细胞活化和改变NK细胞表型。表达抗CD3/CD28单链可变片段（scFvs）的外泌体可递送CAR-mRNA用于生产CAR-T细胞及癌细胞杀伤，证明了用载有mRNA的CART或外泌体改造免疫细胞的可行性。
4.3 生物材料介导的CAR-mRNA体内递送
离体CAR细胞产品的制造成本高且耗时。将编码CAR的mRNA靶向递送至特异性免疫细胞，无需复杂的离体制造过程即可在体内快速生产CAR细胞。为实现主动靶向，可将靶向配体或抗体掺入mRNA纳米载体中，如用抗CD3或抗CD8抗体功能化的聚（β-氨基酯）聚合物纳米载体PBAE-447能将CAR-mRNA靶向递送到淋巴细胞中。
Matthias Stephan等于2017年首次报道了使用靶向T细胞的抗CD3e f（ab′）2片段修饰的基于PBAE-447的DNA纳米载体在体内对T细胞进行编程；2020年该研究组利用抗CD8抗体修饰的类似纳米载体在体内循环T细胞中表达瞬时CAR-mRNA，重复输注纳米制剂诱导肿瘤消退的水平与推注离体工程化CAR-T细胞相似。在一项独立研究中，抗CD5抗体功能化的DLin-MC3-DMA LNP被制备为一种新型抗成纤维细胞活化蛋白（FAP）CAR-mRNA递送平台，单次静脉注射后可在体内瞬时产生抗FAPT细胞，在建立的小鼠高血压心脏损伤和纤维化模型中最终恢复心功能并减少纤维化。总之，这些革命性的体内制造方法有望大幅降低制造成本，并在未来增加CAR疗法的可及性。
05
基于mRNA的CAR疗法的临床转化
表2 2019-2023年间mRNA CAR疗法汇总
06
总结
利用CAR-mRNA工程化免疫细胞能够以无整合风险方式快速、低成本地制造CAR免疫细胞。但用于CAR-mRNA递送的生物材料的开发仍处于早期阶段，且CAR免疫疗法的临床转化研究必须解决以下挑战：
（1）与预防性mRNA疫苗相比，CAR疗法需更高mRNA剂量和重复给药才能达到持久的治疗效果。目前正寻求如缓释mRNA递送系统、mRNA序列优化、自扩增和反式扩增RNA及环状RNA等新兴技术，以延长CAR表达的持续时间；
（2）对冷链储存的要求及mRNA递送系统有限的递送效率和趋向性；
（3）如何开发用于治疗实体瘤和其他难治性自身免疫性疾病的高活性CAR细胞产品。
基于mRNA的CAR疗法虽仍有待解决的问题，但预计CAR和mRNA技术的迭代改进将加快下一代基于mRNA的CAR疗法的开发，以解决肿瘤学之外未满足的医疗需求。
参考文献
[1] Wu J, Wu W, Zhou B, Li B. Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology. Trends Biotechnol. 2024 Feb;42(2):228-240. doi: 10.1016/j.tibtech.2023.08.005.
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