大家好，今天跟大家分享一篇题为 Identifi cation of hypoxic macrop hages in gliobl astoma with thera peutic potential for vasculature norm alization（胶质母细胞瘤中缺氧巨噬细胞的鉴定及其对血管正常化的治疗潜力）弥漫性神经胶质瘤，包括异柠檬酸脱氢酶 (IDH) 野生型 (wt) 胶质母细胞瘤 (GBM) 和 IDH 突变型星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤，是成人中最常见的恶性脑肿瘤。
1
研究背景
单核细胞来源的肿瘤相关巨噬细胞 （Mo-TAM） 强烈浸润弥漫性神经胶质瘤，具有显着的异质性。使用单细胞转录组学，我们绘制了 51 名异柠檬酸脱氢酶 （IDH） 野生型胶质母细胞瘤或 IDH 突变胶质瘤患者的 Mo-TAMs 空间分辨转录景观。我们表征了一个 Mo-TAM 亚群，该亚群位于坏死周围生态位，并被缺氧生态位线索扭曲，以获得缺氧反应特征。
Hypoxia-TAM 通过激活肾上腺髓质素旁分泌信号来破坏内皮粘附连接，从而刺激高通透性新生血管系统，从而阻碍胶质母细胞瘤异种移植物中的药物输送。因此，Hypoxia-TAM 产生的肾上腺髓质素的遗传消融或药理学阻断可恢复血管完整性，提高抗肿瘤药物达拉非尼的瘤内浓度，并实现组合治疗益处。
Hypoxia-TAM 或肾上腺髓质素表达比例增加预示着肿瘤血管通透性高和胶质母细胞瘤的预后变差。我们的研究结果突出了弥漫性神经胶质瘤中 Mo-TAM 的多样性和空间生态位引导的 Mo-TAM 重编程，并指出了靶向缺氧-TAM 以使肿瘤脉管系统正常化的潜在治疗方法。
图一
人弥漫性神经胶质瘤中 Mo-TAMs 的单细胞景观。
图一
（A） 实验工作流程。PDX，患者来源的异种移植物。
（B） 人类神经胶质瘤标本在我们的 scRNA-seq 数据集中的位置。
（C） 均匀流形近似和投影 （UMAP） 图，显示了我们 scRNA-seq 数据集中 31 个人类神经胶质瘤标本中不同类型的髓系细胞（n = 105,839 个细胞）和 Mo-TAM 簇（n = 30,864 个细胞）。Prol.TAM，增殖性 TAM。
（D） 细胞特异性标记物的点图。Avg.exp，平均表达式。
（E） Mo-TAM 簇的基因集变异分析 （GSVA）。NES，标准化富集评分。
（F） 使用我们的 GL261 mGBM scRNA-seq 数据集的 Mo-TAM 聚类的 UMAP 图（n = 4 例）。
（G） 非负最小二乘回归 （NNLS） 分析显示 hGBM（横轴）和 mGBM（纵轴）之间 Mo-TAM 簇的相似性。
（H） 箱线图显示了我们的 scRNA-seq 数据集中 hGBM-IDHwt（n = 20 例）、hAstro-IDHmut（n = 8 例）和 hOligo-IDHmut（n = 3 例）中不同 Mo-TAM 簇的频率。中心线显示中位数，框限表示上四分位数和下四分位数，须线延伸四分位数间距的 1.5 倍;双侧未配对 Wilcoxon 检验。∗，p < 0.05。ns，不显著。
（I） 跨 hGBM（n = 40 例）和 mGBM（n = 12 例）的髓系细胞类型（左图）和 Mo-TAM 簇（右图）细胞组成的堆叠条形图。
图二
Mo-TAM 分类方案的临床相关性。
图二
（A） 使用 TCGA-GBM/LGG 队列（n = 612 例）描绘弥漫性神经胶质瘤中不同 Mo-TAM 簇的估计比例的热图。LGG，低级别胶质瘤。MGMT，O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶。EGFR，表皮生长因子受体。TERT，端粒酶逆转录酶。Chr，染色体。Codel， 共同删除.G-CIMP，神经胶质瘤-CpG 岛甲基化表型。PA 样，毛细胞星形细胞瘤样。LGm6-GBM 是富含组织学低级别胶质瘤的神经胶质瘤亚组，包含具有 GBM 定义组织学标准的肿瘤亚群。NA，不适用。
（B-D）箱线图显示了使用 TCGA-GBM/LGG 队列 （n = 612 例） 具有不同类型 （B） 或分子特征 （C 和 D） 的弥漫性神经胶质瘤中 Mo-TAM 簇的估计比例。中心线显示中位数，框限表示上四分位数和下四分位数，须线延伸到四分位数间距的 1.5 倍。∗，p < 0.05。ns，不显著。双侧未配对 Wilcoxon 检验。
（E） 使用 TCGA-GBM 队列 （n = 233 例） 对患者总生存期进行多变量 Cox 回归分析。带有误差线的森林图显示置信区间的 2.5%（下限）和 97.5%（上限）。
图三
空间分辨率下 Mo-TAMs 的细胞多样性。
图三
（A） 箱线图显示使用来自 Ivy-hGBM 队列的大量 RNA-seq 数据（n = 270 例）在 hGBM 的不同组织学区域中 Mo-TAM 簇的估计比例。带有顶部星号的聚类的估计单元格比例与具有相应星号颜色的聚类的估计单元格比例不同。∗，p < 0.05。双侧未配对 Wilcoxon 检验。
（B） 使用三个公共 hGBM 空间转录组数据集（n = 35，案例 #275）在空间分辨率下显示跨 Mo-TAM 簇的转录程序的表面图。
（C） hGBM 的注释组织学特征 （案例 #275）。比例尺，1 毫米。
（D） 使用公共 hGBM 数据集（n = 35 例）按不同组织学区域排列的空间分辨 hGBM 转录组学的热图。样本编号如热图下方所示。
（E） hGBMs 坏死周围区域的 ADM 、半乳糖凝集素-3 和 CD31 的 H&E 染色和免疫染色。虚线表示距坏死核心的距离 （600 μm/线）。用正方形表示的区域被放大并显示在底部以每种颜色或不同颜色的组合显示。
见图四
缺氧肿瘤线索促进 Hypoxia-TAM 极化。
图四
（A） 单核细胞极化朝向 Mφ 不同状态的示意图。中医来源于 hGBM-3。
（B） Hypoxia-TAM 特征基因表达的 qRT-PCR 分析（n = 3 个样本/组）。Mo，单核细胞。
（C） 说明 Hypoxia-TAM 的缺氧相关基因相互作用和通路富集的网络图。调节缺氧反应计划的核心 TF 用橙色圆圈表示。HRG（黄色）、HPG（红色）和 HNG（蓝色）之间的基因相互作用用相应颜色的线条表示。ECM，细胞外基质。
（D） Hypoxia-TAM 和缺氧反应基因集的预测核心 TFs 子集。
（E） PBMC 衍生的表达 JUN、HIF1A 和 NFKB1 的 shRNA 中 ADM 表达的 qRT-PCR 分析（n = 3 个样品/组）。
（F） ADM 基因启动子上 p50 结合位点的示意图。TSS，转录起始位点。
（G） 使用 PBMC 来源的 Hypoxia-TAM 对 p50 进行 ChIP-qPCR（n = 3 个样品/组）。Ab， 抗体。
（H） 在 PBMC 衍生的缺氧 TAM 中进行的荧光素酶报告基因分析（n = 4 个样品/组）。用含有具有野生型结合位点 （ADMWT） 或突变结合位点 （ADMmut−1， −2） 的 p50。
（I） Hypoxia-TAM 中 p50 介导的 ADM 转录示意图。所有定量面板中的数据都显示为 SD ±平均值;双因子方差分析（B、E 和 H）和双尾未配对 t 检验 （G）。
见图五
Adm 敲除恢复 mGBM 异种移植物中的血管完整性。
图五
（A） hGBM scRNA-seq 数据的 GSVA，显示富含 Hypoxia-TAM 的通路。
（B） 来自我们的 hGBM scRNA-seq 数据集的 Hypoxia-TAM 特征基因的子集，来自基于网络的分泌蛋白数据库 （SPD） 的分泌蛋白编码基因，以及来自 MSigDB 的缺氧反应基因集。
（C） Ccr2-Cre-eGFP （WT） 小鼠和 Adm cKO 小鼠的产生示意图以及 GL261 mGBM 异种移植物中肿瘤血管的后续评估。
（D 和 E）葡聚糖标记的肿瘤脉管系统 （D） 的活体成像和 WT 和 Adm cKO 异种移植物中血管结构 （E） 的定量 （n = 15 张图像/组）。比例尺，100 μm。数据显示为 SD ±平均值;双尾未配对 t 检验。∗∗，p < 0.01。
（F） 异种移植物中微血管的透射电子显微镜 （TEM）（n = 15 张图像/组）。ECs 和它们之间的间隙分别用绿色虚线和红色箭头突出显示。V， 容器。比例尺，5 μm（左图）或 500 nm（右图）。
（G） 异种移植物中 VE-钙粘蛋白、claudin-5、层粘连蛋白、PDGFRβ、尸胺和 CD31 的免疫染色（n = 15 张图像/组）。比例尺，25 μm。
见图六
ADM 通过激活 CRLR 信号传导破坏内皮粘附连接。
图六
（A） WT 和 Adm cKO mGBM 异种移植物的 ECs 中细胞连接分子表达的小提琴图。
（B） 用 rhADM 或载体处理的 HBMECs 中 VE-钙粘蛋白的免疫染色。比例尺，10 μm。
（C 和 D）用缺氧-TAM-CM 和/或 AMA 处理的 HBMEC 中 VE-钙粘蛋白和荧光素-链霉亲和素 （Strep） 的免疫染色 （C） 以及 VE-钙粘蛋白区域和 Strep 区域 （D） 的定量（n = 5 个样品/组）。比例尺，20 μm。++
（E） 使用 CellphoneDB 对我们的 hGBM scRNA-seq 数据的分析推断 ADM 和 ADM 受体（CRLR，受体活性修饰蛋白 2 或 3 [RAMP2 或 RAMP3]）的相互作用。
（F 和 G）hGBMs 中 CRLR、CD31 和 ADM （F） 的免疫染色以及 CRLR 和 CD31 （G） 的共定位率 （n = 5 例）。比例尺，20 μm。
（H 和 I）表达 shCRLR 或非靶向 shRNA （shNT） 的 HBMEC 中 VE-钙粘蛋白和链球菌 （H） 的免疫染色以及 VE-钙粘蛋白区域和链球菌区域 （I） 的定量与 rhADM 刺激相结合（n = 5 个样品/组）。比例尺，20 μm。++
（J 和 K）在指定处理下对 HBMECs 中的 Src、VE-钙粘蛋白及其磷酸化形式进行免疫印迹分析。细胞、细胞质;TCL，总细胞裂解物。
（L） Hypoxia-TAM 和 EC 之间的 ADM-CRLR 旁分泌信号示意图。数据显示为 SD ±平均值（A、D、G 和 I）;双侧未配对 Wilcoxon 检验 （A）;双向方差分析（D 和 I）。
2
研究结果
总之，我们绘制了弥漫性神经胶质瘤中 Mo-TAMs 的景观，表征了缺氧肿瘤生态位中 Hypoxia-TAM 亚群的分子和功能特征，并强调了其预后和治疗意义。除了本研究中表征的 Mo-TAM 亚群之外，弥漫性胶质瘤患者在特定情况下仍然存在例外，例如肿瘤分期、复发状态和对特定治疗的反应。仍需要额外的研究来确定分离的 Mo-TAM 簇和细胞状态的连续谱之间的区别。尽管如此，我们的工作为表征功能离散的 Mo-TAM 簇和开发新的靶向疗法提供了理论依据。返回搜狐，查看更多
责任编辑：