文章题目：National-scale antimicrobial resistance surveillance in wastewater: A comparative analysis of HT qPCR and metagenomic approaches
期刊：Water Research
影响因子：13.4
发表时间：2024年9月15日
研究背景
抗生素耐药性（AMR）是一个复杂的问题，其影响遍及人类、动物和环境等各个方面。考虑到其多因素的性质，人们更加强调在“一个健康”的视角下解决问题，从而认识到这些不同方面从根本上是相互关联的。废水是抗生素耐药性（AMR）的重要储存库，对其进行监测可以深入了解人群层面的AMR趋势，为公共卫生政策提供信息依据。
虽然国家废水监测可以进一步加深我们对废水中抗生素耐药性的理解，但监测数据的价值取决于将监测计划的目标与最合适的方法相结合。目前对于环境中抗生素抗性基因的研究，主要有宏基因组和高通量qPCR两种方法，之前的研究表明，宏基因组学的非靶向性提供了更广泛覆盖ARG谱的明显优势，但会降低方法的灵敏度，而qPCR通常对低丰度基因更敏感。总的来说，对这两种方法的优缺点和一致性进行全面比较的研究仍然有限，尤其是在废水监测方向。
本研究旨在区分威尔士全国废水的空间和时间AMR分布的变化，并进一步评估高通量qPCR芯片和宏基因组学对不同监测目标的适用性。为此，每周从47个威尔士污水处理厂收集综合进水样本，并从一家大型市政医院收集进一步的出水样本（图1）。比较了这两种方法的基因覆盖率、监测高风险ARGs（定义为移动遗传元件（MGEs）、致病宿主和人为相关的ARGs）的能力，以及它们捕捉与环境变量和微生物群落有关的抗生素抗性基因组成变化的能力。
图1 地图显示用于样本收集的47个城市污水处理厂和医院
研究方法
1、废水样品采集和处理
2、废水DNA提取
3、高通量qPCR（共使用96组引物进行高通量qPCR实验，其中ARGs（73个基因）、MGEs（10个基因）、病原菌（5个基因）以及金属和杀菌剂抗性基因等8个其他基因）
4、宏基因组文库的构建和测序
5、序列数据的生物信息学分析
6、统计分析
研究结果
两种方法对废水中ARGs数量和丰度量化的影响
在污水处理厂污水和医院污水中平均分别观察到181和227个个体arg（图2.A）。在所有样本中总共检测到491个独特的ARGs，其中61个也通过qPCR芯片检测到（图2.C）。虽然 qPCR芯片仅限于73种目标ARGs，但两种方法都能在医院废水样本中检测到显著性更高的丰富度。尽管如此，宏基因组分析在污水处理厂污水中检测到的独特ARGs数量高于医院污水（图2.B），这可能是由于污水处理厂的采样点数量更多。
图2（A）所有医院和污水处理厂样本中通过qPCR芯片和宏基因组（注意y轴尺度的不同）确定的ARG丰富度分布的箱形图。(B)韦恩图显示了通过qPCR芯片和宏基因组确定的医院和污水处理厂中检测到的独特arg的数量。(C)维恩图显示了通过qPCR芯片和宏基因组在所有废水样本中检测到的唯一ARGs的总数。注意，只有73个ARGs引物在 qPCR芯片上使用
无论是qPCR芯片还是宏基因座数据，污水处理厂样本中ARGs的总相对丰度都明显低于医院废水。大环内酯类酰胺链霉素（MLS）、四环素、β-内酰胺和氨基糖苷类抗菌药物的ARGs在两组数据中都占主导地位（图3A和B)。两组数据中医院废水中糖肽抗性基因的相对丰度显著增加。然而，宏基因组数据中进一步揭示了利福平和阿尔法霉素的ARGs的高丰度，而qPCR芯片由于没有使用对应引物，所以没有对应的检测数据。
图3 标准化的相对丰度 (A)由qPCR芯片和宏基因组确定的目标ARG组，以及(B)完整宏基因组数据中的ARG类别，取所有污水处理厂和两个废水来源的所有时间点的平均值
在73个qPCR芯片检测的ARGs范围内，废水样品中只有mecA未被检测到（图2.B）。相比之下，宏基因组分别在污水处理厂废水和医院废水中检测到54和58个qPCR芯片目标ARGs。其中未被检测出的包括部分高风险的arg，如mdtL、blaNDM和blaVIM。宏基因组数据的检测频率一直很低，在至少20%的废水样本中，qPCR芯片的73个目标arg中只有35个被检测到。通过qPCR芯片分析发现，aadA7、qepA和vanA等ARGs的相对丰度较高，而通过宏基因组分析发现，tetW、blaCTX和vanRA的相对丰度较高。
不同样本类型之间比较发现，qPCR芯片和宏基因组在污水处理厂废水中msrE和tet39的相对丰度与医院污水相比，显著增加方面是一致的，而ermB则相反。宏基因组数据进一步发现，污水处理厂样本中ctx的相对丰度显著更高，而医院样本中vanRA的相对丰度显著更高。相比之下，qPCR芯片在医院样本中检测到的aadA7相对丰度要高得多，在污水处理厂样本中检测到的vanA相对丰度要高得多。
两种方法对分析废水中ARG成分变化的影响
NMDS用于比较医院和污水处理厂废水样本中的ARG组成随时间的变化。不论是qPCR芯片还是宏基因组，都显示ARG在不同地点明显聚集（图4）。在评估时间变化对ARGs的影响时，采样时间对污水处理厂样品的ARG组成没有明显的影响。相比之下，医院样品的组成在当月发生了明显的变化。
图4 基于Hellinger转换的ARG相对丰度的Bray-Curti矩阵的NMDS排序图显示，ARG组成随时间的变化以及采样医院和污水处理厂采样点之间的差异。通过(A) qPCR芯片和基于(B) qPCR靶向ARGs和(C)完整的宏基因组数据
两种方法对确定环境和人为因素对废水ARGs的影响的影响
在评估采样地点对污水处理厂ARGs组成分布的影响时，NMDS分析发现，ARGs的组成按地理区域聚类，如图1所示。这种效应在一定程度上可以用离散度来解释。在这三个地区中，来自北威尔士和南威尔士的ARGs差异最大。相对于16S rRNA基因拷贝数的ARG总丰度也因采样位点的不同而不同，因此，使用qPCR芯片数据确定的ARG的平均总相对丰度在南威尔士显著低于北威尔士。
基于距离的冗余分析（dbRDA）显示，人为变量和环境变量对污水ARGs产生了显著的影响，qPCR芯片和宏基因组调整后R2分别为0.285 （p < 0.01）和0.207 (p < 0.01)（图5）。这两种方法一致发现环境变量导致了ARG谱中更大比例的差异。其中铵的影响最大（R2 = 0）。但是，两种方法对于某些变量的影响，结果之间存在一些微小的差异。例如，通过对完整数据的宏基因组分析，发现电导率导致的百分比是显著的，然而在qPCR芯片中并没有发现这种显著性(p = 0）。对于人为变量，虽然它们的个体影响在三个数据中均显著，但每个变量导致的差异百分比较低。
图5 基于距离的冗余分析（dbRDA）显示了环境和人为变量对污水处理厂样品ARG分布的影响。通过(A) qPCR芯片和基于(B) qPCR靶向ARGs和(C)完整数据集的宏基因组测定
两种方法对ARGs与细菌属关系的影响
不同样本微生物群落的组成在污水处理厂和医院废水之间存在差异，它们与ARGs的组成相关（PERMANOVA p < 0.01, PERMDISP p > 0.05），并且在医院废水样本中随着时间的推移发生变化。酸多菌属（Acidovorax）、不动杆菌属（Acinetobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）是三个最丰富的属，其中假单胞菌属（Pseudomonadota）是所有样本的优势属。
作为潜在宿主细菌的标志，通过网络分析探索了细菌属和ARG之间的关联模式，基于强（ρ > 0.7）和显著（p < 0.01）的相关性（图6）。结果表明对四环素类耐药的ARG与不同属的相关性最高。例如，qPCR芯片和宏基因组都发现tetO和tetW与两个高度丰富的杆菌属Blautia和Faecalibacterium表现出特别强的相关性（ρ > 0.9）。宏基因组发现了qPCR芯片未发现的进一步相关性，包括假单胞菌与MLS ARGs mefA和msrD之间的关系（图5.B）。然而值得注意的是，无论从哪种方法分析数据，大多数丰富的arg都没有显示出与任何细菌属的任何显著相关性。
图6 网络分析显示前40个最丰富的ARGs与前20个最丰富的细菌属之间的关系，由(A) qPCR芯片和(B)宏基因组确定。连接表示强的、显著的相关性（Spearman相关系数ρ > 0.7, p < 0.01）
结 论
抗生素抗性基因检测在监测新出现的健康威胁、为公共卫生政策的制定提供信息方面具有巨大潜力，并对未来研究提供巨大价值。本研究全面比较了高通量qPCR芯片技术与宏基因组技术，如表1所示。
表1 高通量qPCR芯片和宏基因组用于监测废水中AMR的优势（Green / +）、劣势（Red / -）和细微差异（琥
高通量qPCR芯片技术具有更高的灵敏度，可以检测所有的目标arg，包括低表达的arg丰度。其中包括可移动的金属-β-内酰胺酶基因blaNDM以及多药耐药基因mdtL，这两种基因都被认为对人类健康构成高风险。qPCR芯片监测低丰度基因的能力将有助于早期发现涉及已确定的高风险ARGs的暴发，并确保常规监测数据的连续性。先前对废水和粪便的研究也发现，qPCR技术能更好地区分ARG相对丰度的较小偏差。
另一方面，由于高通量 qPCR芯片仅限于检测预先确定的基因，而宏基因组学可以更好地捕捉抗性基因的多样性。宏基因组不受特定引物的限制，更适合评估总体ARG水平。宏基因组数据的组装可以用于将arg与宿主细菌，MGEs和共定位的耐药基因联系起来。因此，宏基因组数据有利于实现人类健康风险评估和进化分析等目标。
本研究首次比较了高通量qPCR芯片和宏基因组在废水中抗生素抗性监测中的应用。它为寻求设计有效的抗微生物药物及废水监测策略提供了有价值的指导。宏基因组学可以对ARGs进行全面的概述，并有可能为ARG风险评估提供关键的背景信息。高通量qPCR芯片具有更高的灵敏度，能够反映全ARG分布的组成时空动态。尽管如此，不同方法之间灵敏度和覆盖率的差异确实影响了检测到的ARGs及其丰度，影响关于影响因素的数据解读方式。对每种技术的能力和资源需求的深入了解将有助于使监测工作朝着具体目标发展，加强未来对抗生素抗性基因的监测。
总体而言，宏基因组提供了更全面的抗生素抗性基因谱，而高通量qPCR芯片可以对临床耐药重要基因进行敏感定量。我们强调选择与监测目标一致的适当方法的重要性，从而制定有效的基于环境抗生素抗性传播的监测计划。
基因工程产品目录
基因定量服务
高通量qPCR芯片、常规相对定量（mRNA,microRNA,lncRNA,circRNA,外泌体定量等）、常规绝对定量（微生物多样性、功能基因）
生物指标检测服务
土壤类、植物类、食品类、水质类、污染类、医学类、液相、气质、离子色谱
SNP分型服务
Kasp法、Sanger测序法、SNaPshot法
PCR重测序服务
物种鉴定、目的基因扩增测序、PCR产物测序
基础分子生物学服务
引物合成、标记探针引物合成、一代测序、PCR扩增
表观遗传研究
甲基化BSP检测
毛细管电泳分型服务
SSR引物开发、微卫星多态性分析、MSI检测、STR跑板、细胞系鉴定
分子克隆服务
全基因合成、PCR克隆、TA克隆、定点突变、RNA合成
蛋白互作验证服务
核体系酵母单杂/双杂、膜体系酵母双杂、点对点验证
蛋白测定服务
酶联免疫吸附（Elisa）返回搜狐，查看更多
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