上一期我们介绍了Spike-in内标法微生态研究新热潮：扩增子绝对定量（一） ，今天我们接着聊微生态绝对定量的另一种方法——qPCR绝对定量法。
一、项目介绍：qPCR绝对定量法
2020年发表在msystems的题为《Complementing 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing with Total Bacterial Load To Infer Absolute Species Concentrations in the Vaginal Microbiome》的论文，对29例克罗恩病患者和健康人的样本进行qPCR绝对定量分析，表明克罗恩病患者粪便样品中的细胞数比健康对照组低3倍，结果强调了微生物绝对定量的应用价值[1] 。
简单说，qPCR微生物绝对定量就是微生物16S总拷贝数qPCR定量+常规相对定量扩增子测序。
凌恩生物qPCR微生物绝对定量分析步骤如下：
1、利用细菌（16S）或真菌（ITS）的通用引物进行qPCR，获得样本中总细菌或总真菌的总拷贝数；
2、使用常规16S/ITS相对定量扩增子测序获得每个物种相对丰度（百分比）；
3、通过微生物总拷贝数和物种相对丰度的乘积来确定每个微生物的绝对丰度。
图1 qPCR绝对定量原理示意图[2]
图2 qPCR绝对定量分析流程图
二、qPCR绝对定量法应用案例
经典案例1
期刊：nature biotechnology
影响因子：46.9
中文题目：通过qPCR绝对定量法量化样品收集引入的偏差
实验设计与思路
收集10名成年捐献者的粪便样本。如下图采用不同的保存方法，以qPCR绝对定量的结果为标准，评估储存温度和保存液选择对粪便微生物载量和微生物组成测定的影响。
图2 实验设计流程
研究主要结果
研究者使用针对细菌/古细菌16S rRNA基因的qPCR来测量不同保存液和温度条件下每个样品中16S rRNA的总拷贝数，发现OMNIgene保存液可以比单独的标准提取方法更有效地裂解肠道细菌。当储存在Zymo保存液中时，DNA在更高的温度下可能更不稳定。OMNIgene保存液中的样品相较于立即冷冻的、没有保存剂的样品中放线菌门数量没有显著变化，但具有更高的拟杆菌门和厚壁菌门的总量，储存在Zymo保存液中的样品相对则具有更高的厚壁菌门和拟杆菌门的含量，而具有更低的放线菌总量。
图3 绝对定量流程图
研究结论与建议
研究证明了绝对定量在检测个体间微生物总载量的差异和鉴定特定分类群的变化中具有重要的作用，可以提供很多关键信息，然而这些信息在相对丰度结果中是模糊不清的。绝对定量在微生态领域的应用应该被重视。
凌恩实例2
2024年，凌恩客户河海大学李轶团队在Journal of Environmental Management发表题为“Integrating experiments with modeling to understand key bacterial taxa dynamics after episodic mixing of a stratified water column”的文章[3] 。
水力混合可以使分层水体的理化梯度和微生物群落均匀化。这对微生物代谢和水质都有潜在的影响，更好地了解关键类群对这种分层水体混合的响应，有助于理解和预测水力操作对水库微生物群落和营养物质动态的影响。研究者通过qPCR绝对定量法分析了生物反应器中微生物群落的绝对丰度以及变化情况，为水库的有效环境管理措施提供新的见解。
图3反应器中三种细菌功能群的绝对丰度
三、凌恩生物微生物绝对定量解决方法
凌恩生物深耕微生态研究，率先推出扩增子绝对定量产品，包括Spike-in内标法、qPCR绝对定量法，合作客户已发表多篇扩增子绝对定量文章，凌恩生物，期待与你合作！
参考文献
[1] Complementing 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing with Total Bacterial Load To Infer Absolute Species Concentrations in the Vaginal Microbiome.2020,msystems.
[2] Assessing soil bacterial community and dynamics by integrated high-throughput absolute abundance quantification.2018,PeerJ.
[3] Integrating experiments with modeling to understand key bacterial taxa dynamics after episodic mixing of a stratified water column. Journal of Environmental Management,2024.返回搜狐，查看更多
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