本文来源：盛合瑞生物、类器官学社
导语
2024年1月，英国学者在期刊Cancer Research（IF:11.2003）发表了一篇题为“Targeting transcriptional regulation with a CDK9 inhibitor suppresses growth of endocrine- and palbociclib-resistant ER+ breast cancers”的文章。
#1
摘要
Abstract
内分泌治疗和CDK4/6抑制剂联合使用是治疗雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌有效且耐受良好的方法，但许多患者对治疗产生耐药性并复发。然而，确定内分泌治疗耐药性的机制在体外无法充分再现肿瘤内和肿瘤间的异质性，并且缺乏来自女性疾病进展或复发病例的肿瘤样本。
为了更好地理解耐药性的机制，本研究使用了多种细胞系模型来研究耐药疾病，包括2D和3D抑制剂筛选。这些筛选证实了之前报道的促增殖途径（如PI3K-AKT-mTOR）在内分泌治疗耐药中的作用，并额外发现与转录相关的细胞周期蛋白依赖性激酶CDK9是ER+细胞系和患者来源的类器官模拟内分泌治疗耐药疾病的共同靶点，无论是在palbociclib敏感还是耐药背景下。
目前正在进行临床试验的CDK9抑制剂AZD4573在与palbociclib联合用药时，在两种独立的内分泌治疗和palbociclib耐药患者来源的类器官中表现出协同作用。此外，在两个独立的内分泌治疗和palbociclib耐药患者来源的类器官中，用AZD4573联合palbociclib和fulvestrant治疗可导致肿瘤消退。
对肿瘤进行转录谱分析，发现一组转录和细胞周期调节因子仅在联合治疗肿瘤中显著下调。总之，这些发现为克服乳腺癌内分泌治疗和CDK4/6抑制剂的耐药性提供了临床可行的联合治疗策略，并为理解药物疗效的潜在机制提供了见解。
#2
研究思路
Methods
本研究通过筛选多种细胞系模型和患者来源的类器官，调查内分泌治疗和palbociclib对ER+乳腺癌耐药的机制，并确定治疗耐药的新靶点。研究方法包括2D和3D细胞培养、高通量药物筛选、基因表达分析和小鼠异种移植模型。
具体而言，本研究使用各种ER+乳腺癌细胞系，包括长期雌激素剥夺（LTED）细胞系，来模拟内分泌治疗耐药。通过2D和3D细胞培养，本研究筛选了潜在的治疗靶点，并进行了药物组合实验。此外，本研究还使用患者来源的类器官和鼠标异种移植模型来验证治疗策略的有效性，并进行了基因表达分析以研究治疗方法。
#3
主要结果
Results
2D和3D LTED 乳腺癌细胞系激酶抑制剂筛选
LTED乳腺癌细胞系的2D和3D激酶抑制剂筛选采用了综合方法来鉴定内分泌治疗耐药的潜在靶点。该研究对不同浓度的393种药物进行了高通量筛选，揭示了内分泌耐药的关键领域，包括PI3K-AKT-mTOR通路、细胞周期检查点和ER信号传导。这种方法允许识别导致细胞活力显著降低的化合物，为克服乳腺癌耐药性的潜在靶点提供了有价值的见解。
2D筛选中使用了不同药物浓度，随后对响应得分进行了分析，对LTED细胞系对不同化合物的敏感性进行了强有力的评估，强调了针对PI3K-AKT-mTOR通路和细胞周期检查点在内分泌耐药中的重要性。此外，作为常见靶点的ER抑制剂的鉴定进一步强调了内分泌耐药的复杂性以及对多面治疗策略的需求。
此外，在特定药物浓度下的3D测定允许在所有细胞系中鉴定针对PI3K-AKT-mTOR通路的药物，其中多CDK抑制剂flavopiridol和CDK9抑制剂NVP-2成为常见靶点。这种方法提供了对3D培养环境中潜在靶点的更全面理解，这对于捕获肿瘤生物学和药物反应的复杂性至关重要。
靶向CDK9可损害对palbociclib敏感和耐药的LTED细胞系的活力
本研究针对palbociclib敏感和耐药的LTED细胞系，通过使用特异性CDK9抑制剂NVP-2和AZD4573，评估了其对细胞存活能力的影响。研究结果表明，这些CDK9抑制剂对于低浓度下对LTED细胞系的细胞存活能力具有显著的影响，而且耐药的细胞系显示出比敏感细胞系更低的IC50值。这表明CDK9活性可能参与了palbociclib耐药的机制，而针对CDK9可能是克服乳腺癌耐药性的有效策略。
靶向CDK9可损害PDO和PDX模型的活力
本研究针对来自ER+患者原发或转移性肿瘤的13个患者衍生的类器官细胞（PDO）建立的模型，评估了CDK9抑制剂AZD4573对其细胞存活能力的影响。这些PDO具有一系列基因和拷贝数变异，并且其中5个PDO来自曾经接受CDK4/6和芳香化酶抑制剂治疗的患者。
图1. LTED乳腺癌细胞系模型中的2D激酶抑制剂筛选。A，研究示意图。B，最终药物浓度为1 µM的2D筛选（见方法）。Sigma图表示稳健的Z分数排名顺序，其中红色表示药物达到稳健的Z分数≤-2。导致细胞活力降低≥50%的化合物被归类为命中。突出显示以下类别的代表性药物：绿色，针对ER信号传导；蓝色，针对细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）；灰色，针对PI3K-AKT-mTOR通路。C，最终药物浓度为100 nM的2D筛选。导致细胞活力降低≥50%的化合物被归类为命中。维恩图说明了三个或四个细胞系组中常见的命中数。
图2. LTED和palbociclib耐药乳腺癌细胞系模型的3D激酶抑制剂筛选3D测定在最终药物浓度为250 nM下进行（见方法）。具有稳健的Z分数<-1.65的化合物被归类为命中。A，维恩图说明了三个或四个细胞系组中常见的命中数。B，比较palbociclib敏感的MCF7 LTED和HCC1428 LTED乳腺癌细胞系及其palbociclib耐药衍生物中的命中情况。C，比较palbociclib耐药细胞系MCF7 LTEDPalboR和HCC1428 LTEDPalboR中的命中情况。
图3. CDK9抑制剂损害2D和3D培养中的细胞活力。A，B 4,000-8,000个细胞被种植在96孔组织培养板中，并在第1和3天用CDK9抑制剂处理，A，NVP-2或B，AZD4573，在所示浓度下。细胞活力在第7天使用CellTiter-Glo测定。平均值±SEM。数据表示与载体对照相比，NVP-2/AZD4573处理后活力细胞的百分比。n=4个技术，n=1个生物重复。C，2,500个细胞被种植在96孔超低附着圆形底板上。形成的球体在第3和6天被处理。细胞活力在第10天（终点）进行评估。图形显示与载体对照相比，活力AZD4573处理细胞的百分比。n=1个生物重复，n=4个技术重复。平均值±SEM。代表性图像和终点治疗后0 nM、3 nM或30 nM AZD4573的球体面积定量。比例尺，1毫米。D，3,000-5,000个MCF7 LTEDWT、LTEDY537C或LTEDPalboR细胞被种植在2D 96孔组织培养板上，并在第1和3天用逐渐升高的palbociclib和AZD4573处理。细胞活力在第7天使用CellTiter-Glo测定。
图4. CDK9抑制剂AZD4573驱动内分泌治疗和palbociclib耐药PDXs的肿瘤消退。A，2-5×104分离的PDO细胞被种植在96孔组织培养板中的10% Matrigel中。形成的类器官在第2天接受治疗。细胞活力在第7天进行评估。剂量反应曲线显示AZD4573处理的活力细胞百分比与载体对照相比（n=4孔/PDO）。药物反应以S形剂量反应曲线表示。IC50和AUC（曲线下面积）值如图所示。ND，未测定。B，HBCx-180和C，HBCx-134-palboR31 PDXs被接种到8周龄瑞士裸小鼠中。当肿瘤达到100-200 mm3时，随机分配到不同的组别并进行治疗，包括载体、palbociclib + fulvestrant、AZD4573或palbociclib + fulvestrant + AZD4573（V，P+F，A，P+F+A）。上图，相对肿瘤体积±SD。HBCx-180 n=6-7，HBCx-134-palboR31 n=7-10小鼠/组（双向Mann-Whitney U检验）。下图，瀑布图显示肿瘤体积相对于基线的变化百分比，HBCx-180 n=5-7，HBCx-134-palboR31 n=7-8小鼠/组。D-G，对HBCx-134-palboR31处理过的肿瘤进行RNA-Seq分析。D，在肿瘤治疗组比较中，使用显著性阈值|log2FC| > 1和FDR调整的p < 0.05，差异上下调节的基因数量。E，在肿瘤治疗组中，MYC、MYB和MCL1的表达。p值使用's edgeR's quasi-likelihood F-test实现估计。F，在palbociclib + fulvestrant + AZD4573处理的肿瘤中，协同性下调表达的基因的热图（log2FC > 1，FDR调整的p < 0.05）。G，在肿瘤治疗组中，MYCN和WEE1的表达。H，5000个MCF7 LTEDY537C或T47D LTED（L）或LTEDPalboR（LP）细胞被种植在96孔超低附着圆形底板上，形成的球体在第3和第6天接受治疗。细胞活力在第10天进行评估。
总结
该研究表明，使用特定的抑制剂（如AZD4573）靶向CDK9可以显著损害palbociclib敏感性和耐药的LTED细胞系的活力，以及患者来源的类器官（PDO）和PDX模型。这些发现表明，CDK9活性可能有助于palbociclib的耐药性，而CDK9抑制可能是一种有效的策略来克服ER+乳腺癌的内分泌和CDK4/6抑制剂的耐药性。此外，该研究强调了CDK9和CDK4/6抑制剂联合使用的潜在协同作用，为开发新的治疗方法提供了宝贵的见解。总体而言，这项研究强调了靶向与转录相关的CDK9在解决治疗耐药的ER+乳腺癌方面的意义，并为进一步探索CDK9抑制剂作为有希望的治疗策略提供了理由。
参考信息
Targeting transcriptional regulation with a CDK9 inhibitor suppresses growth of endocrine- and palbociclib-resistant ER+ breast cancers.Cancer Res. 2023 Oct 6. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-23-0650.PMID: 37801608.
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