- 黄曲霉毒素M1（AFM1）定量酶联免疫检测试剂盒说明书
- ELISA-kit for Aflatoxin M1
- 本测试盒用间接竞争免疫分析法定量测定奶及奶制品中黄曲霉毒素M1。该测试盒反应孔可拆卸，可测单份样品，也可测多份样品。定量分析时需有含450nm波长的微孔板酶标仪。
- 1 概要
- 黄曲霉毒素是曲霉菌属的高毒代谢产物，是一种强烈的致癌物；黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的代谢产物，是通过喂食动物带有黄曲霉毒素B1的饲料而分泌到奶中的。检测黄曲霉毒素M1的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等。HPLC法灵敏度较高，结果稳定，但所需仪器设备昂贵，样品准备耗时长，不适于大量样品的筛选；TLC法为目测半定量，并且需要大量接触毒素标准品，不利于操作者健康。用此黄曲霉毒素M1 ELISA检测试剂盒可快速、准确地检测出奶及奶粉中的黄曲霉毒素M1的含量是否超出国家标准及国际标准。我国鲜乳中黄曲霉毒素M1限量标准是0.5 µg/kg(500 ppt)。如在使用过程中遇到问题，请与工作华南生物工程有限公司技术人员联系。
- 2 测定原理
- 如在使用过程中遇到问题，请与工作华南生物工程有限公司技术人员联系。本测试盒用固相酶联免疫吸附原理，利用间接竞争ELISA法进行测定。用抗原包被微孔板，加入黄曲霉毒素M1标准品或样品、抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体进行免疫反应后，将未与包被抗原结合的抗体洗去；再加入酶标记的抗鼠IgG抗体孵育，加入底物显色，终止液终止反应后，用酶标仪在450nm处测定OD值。 3 提供的试剂 微孔板 包被有AFM1-BSA
- 5个浓度的AFM1毒素标准溶液（0，0.02，0.05，1，2ng/mL）各1mL，直接使用
- AFM1抗体溶液（6mL）.….….….….….….….….…………………直接使用，红色帽
- 酶标物(1mL).….. .….….….….….….….….….……………………… 使用时按要求稀释
- 酶稀释液(12mL)….. .….. .….. .….. .…. .….….….….….….….….….直接使用，绿色帽
- 显色剂(12mL).….. .….. .….. .….. .….. .….. .….….….….….….…. …直接使用，蓝色帽
- 终止液(6mL)………. .….. .….….….….….….….….….….….. . ………直接使用，黄色帽
- 浓缩洗涤液(10mL) ...….……….….. .….. .….. .….….….….…使用时按要求稀释，白色帽
- 4 盒中未提供，需自备物品
- 4.1 设备
- 微孔板酶标仪（含450nm）：定量分析用，
- 分析天平，微量移液器，刻度量筒，冷冻离心机
- 4.2 试剂
- 去离子或水蒸馏水
- 5 操作者注意事项
- ----标准溶液中含有黄曲霉毒素M1，应特别小心。
- ----使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素M1溶液最好用pH7的次氯酸溶液（10%v/v）浸泡过夜。
- ----终止液为1N硫酸，避免接触皮肤。
- ----不要使用过了有效日期的试剂盒。
- ----不要交换使用不同批号盒中的试剂。
- 6 储存条件
- ----保存试剂盒于2-8℃。不要冷冻
- ----显色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
- ----将不用的微孔板放进原铝箔袋中，置2-8℃保存。
- 7 试剂变质的标志
- ----0ng/mL标准的吸光度值小于0.6个单位 (A450nm<0.6)时，表示试剂可能变质。
- 8 样品处理
- 样品应当保存在阴凉避光之处或冷藏保存
- 8.1 牛奶
- ----取牛奶样品，用冷冻离心机（4000rpm，10℃）离心10分钟去除脂肪；如无冷冻离心机，可先将样品冷却到10℃，再离心
- ----用吸液管彻底去除上层奶油
- ----取50μL脱脂牛奶用于分析
- 8.2 奶粉
- ----用分析天平称取10g奶粉（精确到0.01g）
- ----加100mL去离子水或蒸馏水，震荡5分钟，充分溶解
- ----余步骤按照8.1牛奶样品
- 注意：样品的量可能由于条件所限需要增加或减少，但体积比必须保持一致。 9 酶标免疫分析程序
- 9.1测定之前注意事项 1. 使用之前将所有试剂回升至室温20-30℃
- 2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8 ℃
- 3. 每步加样时间控制在5min。
- 4. 孵育过程中应避光。
- 9.2 试剂稀释
- 1. 酶标物稀释：酶标物稀释液与酶标物按体积比19:1稀释。
- 2. 浓缩洗涤液稀释：使用时用去离子水或蒸馏水与本浓缩液按体积比9:1稀释。
- 9.3 测定程序
- 1. 根据样品数量将足够数量的板条插入微孔架，记录样品及标准的位置。
- 2. 加入50mL标准品或处理好的样品到微孔，每个标准和样品必须使用新的吸头。
- 3. 加入50mLAFM1单克隆抗体使用液到每个微孔（注意移液器管尖不要接触到放进孔中的液体，避免交叉污染）37℃孵育60min。
- 4. 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板3min×3次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。
- 5. 加入酶标物100mL，37℃孵育30min。
- 6. 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板3min×3次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔 中液体。
- 7. 加入显色剂100mL, 37℃孵育10min。
- 8. 加入终止液50mL，立即用酶标仪测定吸光度值（OD值）。
- 10 定量分析
- 以标准溶液OD值与0ng/mL OD值的比值为纵坐标，所对应标准溶液浓度（ng/mL）的对数值为横坐标，制作标准曲线。求得样品OD值与0ng/mL标准OD的比值，从曲线上得到对应点的横坐标，即为AFM1浓度的对数值，求得反对数即为测定液中AFM1浓度C（ng/mL），
- 1）牛奶中AFM1含量：从曲线上得出的AFM1浓度值（ng/mL）即为牛奶中AFM1含量(μg/kg)。
- 2）按下列公式计算奶粉样品中AFM1含量：
- 奶粉中黄曲霉毒素M1含量（mg/kg）= C×K
- 式中：C：测定液中AFM1含量（ng/mL）
- K：测定液对样品的稀释倍数（本提取方法为10）
- 11试剂盒主要技术指标及参数
- 测试盒最低检出浓度0.07ng/mL，回收率70%-130%，与黄曲霉毒素B1交叉反应系数小于10%，与黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2交叉反应系数小于1%，试剂盒校正曲线的线性范围0.02ng/mL -2ng/mL，试剂盒条内变异＜10%，条间变异＜15%。
- 附图（仅供参考） 黄曲霉毒素M1标准抑制曲线 浓度对数（ng/mL）
如在使用过程中遇到问题，请与工作华南生物工程有限公司技术人员联系。
- 霉变谷物中毒参考资料
- (一)流行病学特点
- 霉变谷物中毒可发生在任何季节，中毒发生主要在南方高温高湿地区，如广东、广西、福建等省，以玉米为主食的地区较易发生此类中毒。
- (二)临床表现和预后
- 1.黄曲霉毒素引起的急性中毒临床特点是有短时间、一过性的发热、呕吐、厌食、黄疸，有些症状较轻的病人可以恢复，重症病人在2～3周内出现腹水、下肢浮肿、肝和脾肿大，很快死亡。
- 2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇引起的急性中毒临床表现与赤霉病麦中毒相同(见“赤霉病麦中毒”).预后良好。
- (三)诊断依据
- 1.黄曲霉毒素中毒的病人有肯定的近期进食发霉的主食(玉米、大米等)的历史，食后除有一般消化系统症状外，还有黄疸、腹水、肝、睥肿大等体征。实验室检查病人吃剩的主食可有发霉变质现象，且每千克样品中可测出毫克数量计的黄曲霉毒素.从病人血液或尿中可测出黄曲霉毒素M1。
- 2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇引起的急性中毒病人有肯定的近期进食发霉变质玉米等谷物的历史。食后有恶心、呕吐、头晕、头痛、腹泻、腹痛等一般消化系统和神经系统症状。病程短，预后良好。可采取病人吃剩的玉米等食品，检测其中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
- 具体诊断依据行业标准WS／T11—1996《霉变谷物中呕吐毒素食物中毒诊断标准及处理原则》。
- (四)治疗原则
- 1.黄曲霉毒素食物中毒
- (1)停止食用霉变食物。并立即给予催吐、洗胃和导泻。
- (2)急性轻度中毒可门诊或住院观察，对症治疗。
- (3)急性重度中毒病人需住院治疗，按急性中毒性肝炎的方案治疗。
- 2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇食物中毒
- (1)立即停止食用霉变食品。
- (2)轻度中毒病人无需治疗，1～2天内即可痊愈。重症病人对症治疗。
- (五)预防与控制
- 1.黄曲霉毒素食物中毒
- (1)收获后的粮食要及时晒干，使粮食中水分降低到安全水分以下。
- (2)挑除霉粒 可使粮食中黄曲霉毒素大大降低，玉米、花生等可用此法。
- (3)碾轧加工 可用于受毒素污染的大米，精度越高，去毒效果越好；
- (4)加水搓洗 淘洗大米时，用手搓洗，随水倾去悬浮物.反复搓洗5～6次,可除去大部分毒素。
- (5)脱胚去毒 将玉米磨成3～4mm的碎粒，加清水浸泡，每天换水3～4次，连续泡3天，可使玉米中黄曲霉毒素由200～670ug／kg降低到0。处理后的玉米可制成淀粉。
- (6)花生油、玉米油等食用植物油可加碱去毒后再用白陶土吸附处理。可使毒素的含量大大降低。
- (7)加强粮食及油料作物中黄曲霉毒素的监测。
- 2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇中毒
- (1)加强谷物在田间和贮藏期的防霉措施。
- 1)选用抗赤霉病的品种。
- 2)降低田间水位，做好开沟排水。
- 3)使用高效、低毒和低残留杀菌剂。
- 4)及时脱粒、晾晒，降低谷物水分含量至安全水分。
- 5)贮存的粮食要勤翻晒，注意通风.防治病菌继续繁殖产毒。
- (2)加强粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的监测。
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