FluoTag-X4抗GFP单结构域抗体与天然GFP信号高度相关，在定量共定位方面优于传统GFP抗体。
在以下方法中，应通过原生GFP信号与抗体染色信号的共定位研究来突出这一优势。对转基因小胶质细胞CX3CR1-GFP+/-小鼠（Jung等人，2000年）的脑切片进行了免疫组织化学染色，使用的是FluoTag®-X4抗GFP抗体或传统的间接免疫染色。
通过合并图片、散点图和相关系数分析共定位
共定位可以在两个荧光信号的合并图片中可视化。原生GFP通道（绿色 - 图1A，2A）和抗体染色通道（红色 - 图1B，2B）的重叠像素显示为黄色（图1C，2C）。合并图片清楚地显示，FluoTag®-X4抗GFP染色结果在微胶质细胞的不同区域产生了均匀的共定位，而传统染色在微胶质细胞的不同区域产生了波动。细胞核显示出明亮的原生GFP信号，但只有非常微弱的抗体染色（图2A-C，星号），这可能是由于传统抗体进入细胞核的穿透性较差或空间障碍所致。相比之下，微胶质细胞的突起与GFP信号相比，在抗体染色下显得更亮（图2A-C，箭头），很可能是由于二级试剂的高放大作用。散点图是另一种有用的工具，用于可视化共定位（ImageJ，Dunn等人，2011）。在这里，每个像素的颜色强度相互对比（图1D，2D）。在高共定位的情况下，点会围绕一条直线聚集，如图1D中可以很好地看到。
图1：使用单域FluoTag®-X4抗GFP抗体的直接免疫染色。
（A）原生GFP信号，
（B）FluoTag®-X4抗GFP抗体（AB）染色，
（C）合并图片以及
（D）带有皮尔逊相关系数（PCC）的散点图。
图2：使用传统抗GFP抗体的间接免疫染色。
（A）原生GFP信号，
（B）传统抗体（AB）染色，
（C）合并图片以及
（D）带有皮尔逊相关系数（PCC）的散点图。
这两种可视化方法，合并图片和散点图，都表明FluoTag®-X4抗GFP染色与原生GFP信号的相关性高于传统染色。接下来，使用皮尔逊相关系数（PCC）量化了相关性，这是一个稳健的工具，不受增益或偏移的影响（ImageJ，Adler等人，2010，Bolte等人，2006）。如果完全正相关，PCC为1；如果没有相关性，PCC为0。量化显示，FluoTag®-X4抗GFP-At542与原生GFP信号的相关性令人印象深刻，PCC为0.9732（图1D），而传统间接抗体染色与原生GFP信号的相关性仅为0.7676（图2D）。对每组三张图片的分析确认了这一结果，具有高度的统计显著性p<0.001。
这个实验再次说明，小的直接结合的单域抗体具有单价结合特性，显示出非常好的组织穿透性，并产生准确反映给定蛋白表达水平和分布的染色模式。它们不受二级试剂高放大作用的影响，这使得它们在定量共定位研究中优于传统的间接免疫染色。
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文献参考：
Adler et al., 2010: Quantifying Colocalization by Correlation: The Pearson Correlation Coefficient is Superior to the Mander’s Overlap Coefficient. PMID: 20653013
Bolte et al., 2006: A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. PMID: 17210054
Dunn et al., 2011: A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. PMID: 21209361
Jung et al., 2000: Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. PMID: 10805752
Prasher et al., 1992: Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. PMID: 1347277
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