大家好，今天跟大家分享一篇近日，浙江大学邵逸夫医院团队、安徽医科大学第一附属医院团队、南京鼓楼医院团队联合北京中日友好医院团队在Nature Communi cations发表了题为“Unraveling the spatial organi zation and develo pment of human thymocytes through integr ation of spatial transcrip tomics and single-cell multi-omics profiling”的文章。研究团队开发了TSO-his（组织结构的转录组学分割）工具，用于整合单细胞和空间转录组学的多模态数据，并破译人类胸腺的复杂结构。
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研究背景
胸腺的结构成分对于指导 T 细胞发育至关重要，但仍然缺乏全面的空间视图。在这里，我们开发了 TSO-his 工具，旨在整合来自单细胞和空间转录组学的多模态数据，以破译人类胸腺的复杂结构。具体来说，我们表征了细胞类型和关键标志物的动态变化，确定 ELOVL4 是皮层中 CD4 T 细胞阳性选择的介质。
利用 TSO-his 的映射功能，我们以单细胞分辨率重建胸腺空间结构，并概括经典细胞类型及其对 T 细胞发育的基本共定位;此外，还确定了以前未知的共定位关系，例如 CD8αα 与记忆 B 细胞和单核细胞的共定位关系。
结合 VDJ 测序数据，我们还描绘了 αβ T 细胞发育过程中不同的中间胸腺细胞状态。总体而言，这些见解增强了我们对胸腺生物学的理解，并可能为针对 T 细胞介导的免疫反应的治疗干预提供信息。
图一
生成不同年龄组人类胸腺发育的转录图谱。
图一
a 研究设计的示意图。
b 正常胸腺样本总结。不同的形状和颜色表示数据类型，箭头表示从产前到老年阶段的过渡。
c 从正常胸腺样本中收集的单细胞的二维均匀流形近似和投影 （UMAP）。带注释的单元格类型采用颜色编码。
d 点图显示用于细胞注释的标记基因表达。点的大小表示该标记物在特定细胞类型中表达的比例，颜色表示平均表达水平。左侧和顶部的注释栏表示宽单元格子集，并带有相应的颜色代码。
e 按年龄组着色的 UMAP，包括产前、儿科、成人和老年组。
f 通过比值 （RO / E)21观察到的细胞数与预期的随机细胞数（即，子集和年龄之间没有关联，允许观察预期的细胞数）。
图二
胸腺空间转录组学 （ST） 切片中关键区域的鉴定，以及细胞类型随空间距离变化的描述。
图二
a 用于识别胸腺皮质和髓质区域并根据空间转录组数据 （TSO-his） 分割胸腺小叶的算法。详细信息在 “方法” 部分提供。
b 通过 TSO-his 分析确定的 Thy5（顶部）和 Thy7（底部）胸腺切片的关键组织区域。左：苏木精和伊红 （H&E） 切片（对照）;中：空间斑点的髓质分数;右：皮层、延髓和髓质皮层 （M-C） 边界。胸腺切片中的髓质中心点标记为绿色。其他 ST 切片的分割结果可在补充图 中找到。3e、f（n = 8 个生物学重复）。
c 使用 TSO-his 根据最近邻策略将胸腺 ST 切片解剖成小叶。左：Thy5;右：Thy7。
d 八个胸腺切片的小叶中已识别的皮质和髓质区域的分层聚类，通过区域之间平均表达谱的 Pearson 相关性来测量相似性。
e 应用于 8 个胸腺 ST 切片的时空距离，说明了从远端皮层到髓质中心的 34 种细胞类型的特征基因评分分布。这些线表示像元类型的空间距离和特征分数之间的关系，使用广义线性模型进行平滑处理，这些线周围的阴影区域表示拟合值的 95% 置信区间。
f、gThy 5 （f） 和 Thy7 （g） 样品的空间点分数基于细胞类型的特征基因，并使用 Nebulosa R 软件包中的“wkde”方法进行平滑处理70.显示了皮质区域 （cTECs、DP_blast 和 abT（entry）） 和髓质区域 （mTEC、CD4 T 和 CD8 T） 的富集群体。
h 显示源自 CellChat 的细胞间通信的网络图。（左）Fb 与 T 细胞和（右）VSMC 与 T 细胞。边的粗细表示交互的强度。节点根据单元格类型进行颜色编码。
（i） CellChat 之间共享和独特的显着配体-受体相互作用 （%） 的比较++31和 CellPhoneDB32工具。（左）Fb 与 T 细胞，（右）VSMC 与 T 细胞。（j） 显示所选重要配体-受体对的点图。（左）Fb 与 T 细胞和（右）VSMC 与 T 细胞。点的颜色反映通信概率，点大小表示计算的 p 值。空白区域表示通信概率为零。P 值是根据单侧排列检验计算的。cTEC：皮质胸腺上皮细胞，mTEC：髓质胸腺上皮细胞，VSMC：血管平滑肌细胞，Fb：成纤维细胞，DP_blast：双阳性原始细胞，DP_re：双阳性重排细胞。源数据作为 源数据 文件提供。
图三
探索胸腺 T 细胞发育和分化中的空间基因表达模式和功能后果。
图三
a 热图显示了在儿科空间转录组学 （ST） 切片中表现出随距离显着变化的基因的平滑表达。红色箭头表示基因表达从远端皮层到髓质中心的变化方向（补充数据 3）。通过切割分层聚类树分配两个广泛的基因簇 （Cluster1 和 Cluster2），并且选择性地显示了在每个簇中富集的生物过程 （BP） 项。髓质指示基因（补充表 2）与 T 细胞分化状态密切相关8,33突出显示。
b 标记基因热图，仅分别显示皮质和髓质区域的前 30 个过表达基因。斑点按 ST 样品排序。
c 随距离 （DVG） 显著变化的基因与髓质和皮质区域之间的差异表达基因 （DEG） 之间的重叠。
d 8 个胸腺 ST 切片中前 10 个 DEGs 的空间分布;5 例在髓质区上调，其余在皮质区上调。使用自然样条回归模型对代表空间距离和基因表达之间关系的线条进行平滑处理，这些线条周围的阴影区域表示拟合值的 95% 置信区间。
e、f胸腺细胞类型中 （e） CCL19、CCR7 和 （f） ELOVL4 和 CD99 的表达水平（左）和空间定位（右）。g、h小提琴图与箱形图相结合，显示了 ELOVL4（左）和 CD99（中）表达的分布，以及 T 细胞受体α （TCRα） 相关基因评分（右）在我们的胸腺单细胞数据集中DP_blast和 DP_re 细胞类型中的分布。中位数、四分位距 （IQR） 作为从箱体延伸到上/下四分位数的箱形边界，± IQR × 1.5。P 值是从双侧 t 检验获得的。我们的胸腺数据 （DP_blast=15,812 个细胞;DP_re=52,320 个细胞;（g） Park 等人的数据，（DP（P） = 12,057 个细胞;DP（Q） = 11,219 个细胞。
i， j 散点图显示所选基因的表达和 TCR 的特征评分α DP_re 期随年龄的变化。每个数据点代表一个单独的样本，虚线表示黄土拟合度。TCRα 的特征评分由其相关的 TRAV* 基因推断。（i） ELOVL4 与 TCRα;（j） CD99 与 TCRα。
k 散点图显示了 CD99（左）和 ELOVL4（右）表达与 TCR 特征评分之间的关联α分别。阴影区域分别表示线性回归模型的 95% 置信区间。“R” 表示 Pearson 相关系数，p 值是从双侧 t 检验获得的。DP_blast：双阳性原始细胞，DP_re：双阳性重排细胞。源数据作为 源数据 文件提供。
见图四
使用 CRISPR/Cas9 介导的敲除研究胸腺发育中皮质区域富集的基因。
图四
a 如图所示，使用不同阶段的小鼠和人胸腺细胞对 ELOVL4 蛋白进行免疫印迹分析。
b、c如图所示，使用门控胸腺细胞的中位荧光强度 （MFI） 对 CD99 表达进行流式细胞术分析。汇总图表示为 SD ±平均值。P 值由未配对的双尾学生 t 检验确定。
d 使用骨髓嵌合小鼠的慢病毒 CRISPR/Cas9 介导的敲除示意图。
e 使用来自 CRISPR/Cas9 介导的 ELOVL4 敲除小鼠和对照小鼠的幼稚 T 细胞对 ELOVL4 蛋白进行免疫印迹分析。
f-h 胸腺细胞亚群的流式细胞术分析，显示胸腺细胞总数和指定亚群频率的代表性 FACS 图（左）和汇总图（右）（n = 3 个生物学重复）。我、J使用从 CRISPR/Cas9 介导的 ELOVL4 敲除和对照小鼠的脾细胞中纯化的幼稚 CD4 T 细胞和幼稚 CD8 T 细胞（n = 4 个生物学重复）收集的上清液，ELISA 分析 IFN-γ 和 IL-2 表达，用板结合的抗 CD3 和抗 CD28 抗体刺激 48 小时。40 小时后，用 [3H] 胸苷脉冲标记受刺激的 T 细胞 8 小时，测量 T 细胞增殖测定。
k Treg 细胞 （CD4CD25Foxp3） 的流式细胞术分析显示了绝对数量和频率（n = 3 个生物重复）的代表性 FACS 图（左）和汇总图（右）。
（l） 指定组内脾细胞 T 细胞上 CD99 表面表达的流式细胞术分析。m-o胸腺细胞亚群的流式细胞术分析，显示胸腺细胞总数和指定亚群频率的代表性 FACS 图（左）和汇总图（右）。
p、q使用从初始 CD4 T 细胞 （CD4CD44 收集的上清液对干扰素-γ （IFN-γ） 和 IL-2 表达进行 ELISA 分析+++++++瞧CD62L你好） 和初始 CD8 T 细胞 （CD8CD44++瞧CD62L你好） 从 CRISPR/Cas9 介导的 CD99 敲除小鼠和对照小鼠（n = 4 个生物重复）的脾细胞中纯化，用板结合的抗 CD3 和抗 CD28 抗体刺激 48 小时。40 小时后，用 [3H] 胸苷脉冲标记受刺激的 T 细胞 8 小时，测量 T 细胞增殖测定。以 8 周龄雌性小鼠为实验对象。
见图五
从正常胸腺到空间坐标的单个细胞投影。
图五
a TSO-hismap 将单细胞投影到空间转录组学 （ST） 切片上的策略。完整算法的详细信息可以在 “Methods” 部分找到。
b 显示 SrtCT、CellTrek、CARD 和 TSO-hismap 性能的箱线图。引入了各种噪声水平 （5% 、 10% 和 15% ），以评估在模拟 ST 数据集中将单个细胞分配到正确位置的准确性。中位数、四分位距 （IQR） 作为从箱体延伸到上/下四分位数的箱形边界，± IQR × 1.5。使用双侧 t 检验获得 P 值。
c 使用 TSO 组图将胸腺单细胞投影到 ST 坐标。示例包括 Thy5、Thy6 和 Thy7。每个点代表来自正常胸腺的单个细胞，细胞类型用颜色编码。显示了一个扩大的小叶，髓质中心为 ATAGTTCCACCCACTC-1。
d Sankey 图显示了使用 TSO 组图投影到 ST 切片的髓质、皮质和髓质皮层 （MC） 边界区域的每种细胞类型的单细胞的比例。线条的粗细表示投影到该区域的一种像元类型的比例。
e 气泡图显示了 TSO-hismap 推断的皮质、髓质和 M-C 边界区域中胸腺细胞的全景，基于 8 个儿科 ST 切片。点的大小表示该细胞类型在特定区域中的比例，而颜色阴影表示该细胞类型与髓质中心的平均距离。
f B_memory、CD8aa、DC 和 Mono 在 ST 切片中的单细胞分辨分布（左：Thy5，右：Thy7）。每个点代表一个单独的单元格。B_memory：记忆 B 细胞，DC：树突状细胞，单核细胞：单核细胞。
见图六
胸腺细胞类型的空间共定位和表征。
图六
a 以 TSS 为中心的方式可视化跨越整个基因组的 a 共存于空间转录组学 （ST） 切片中的胸腺细胞类型图谱。每个顶点代表一种细胞类型，边缘的粗细表示 J 指数的强度（参见“方法”）。J 指数值低于 0.3 的边缘不会显示，小于 0.6 的边缘为灰色，高于 0.6 的边缘由特定单元格类型的颜色代码突出显示。此外，由于 ST 切片受到污染，未考虑 Ery。
b 结合 ST 图像 （以 Thy5 和 Thy7 为例），可以看到细胞类型的空间共定位。cTEC vs. DP_re（上）和 CD8aa vs. B_memory vs. 单晶 vs. DC（下）。每个点代表通过 TSO-hismap 投影到空间坐标上的一个单元格，单元格类型用颜色编码。
c 免疫荧光染色显示胸腺（5 个月大）中 GNG4 （CD8aa）、IgA （B_memory） 和 CD14 （Mono） 的表达模式。比例尺：100 um（中图）和 50 um（底板;放大切片）（n = 3 个技术重复）。
d 从远端皮层到延髓内层，人类 T 细胞发育不同阶段胸腺细胞类型的空间共定位示意图。Ery：红细胞，B_memory：记忆 B 细胞，cTEC：皮质胸腺上皮细胞，Mono：单核细胞，DC：树突状细胞，DP_re：双阳性重排细胞。
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研究结果
总之，我们的研究深入研究了胸腺细胞发育、单细胞分辨率的空间组织以及与 T 细胞成熟相关的 TCR 信号传导的动态变化。它为基本免疫机制和潜在的临床应用提供了有价值的见解和数据资源。返回搜狐，查看更多
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