昆虫杆状病毒表达载体系统 (Baculovirus expression vector system, BEVS) 已广泛应用于外源蛋白的表达、药物筛选、疫苗开发、基因治疗等领域，尤其是在疫苗领域，如病毒样颗粒 (VLP) 等的制备中表现出色，本文将为您介绍 如何利用昆虫杆状病毒表达系统进行高效的疫苗工艺开发。
昆虫杆状病毒表达载体系统与大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等表达系统相比，具有其独特优势：
1
可以 高效表达外源基因，杆状病毒基因组中的强启动子，可以实现目的基因的高效转录。
2
安全性高，杆状病毒具有较高的种属特异性，只能感染特定的昆虫细胞，生物安全性高。
3
杆状病毒基因组可容纳大片段外源基因，可以同时表达多个蛋白，非常 适合结构复杂的抗原表达，如VLP。
4
昆虫细胞可对目的蛋白进行 翻译后修饰，如糖基化、磷酸化、乙酰化等。
5
培养体系 易于放大，昆虫细胞可在无血清培养基中进行悬浮培养，便于工艺优化。
病毒样颗粒 (virus-like particle, VLP) 是一种高度结构化的蛋白颗粒，由病毒的单一或多个结构蛋白自行装配而成，其在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。目前已经上市的利用昆虫杆状病毒表达系统开发的疫苗有新冠疫苗、乙肝疫苗、宫颈癌疫苗、流感疫苗等。
一
昆虫细胞培养工艺
BEVS是一种瞬时蛋白表达系统，当昆虫细胞培养至预期的细胞密度时，用含有目的基因的重组杆状病毒感染昆虫细胞。因此，BEVS主要由三部分组成，即 细胞扩增、 病毒扩增和 蛋白生产（如图1所示）。一般在细胞扩增阶段，昆虫细胞在对数生长中期按照1:10的稀释比例进行传代，而最佳的感染时间则是在对数生长期的早期。在蛋白生产阶段，随着病毒的加入，病毒开始控制宿主细胞，细胞生长停滞，蛋白开始产生。重组杆状病毒Stock的制备会使用比生产阶段更低的 感染复数 (multiplicity of infection, MOI) ，而且病毒Stock也会提前收获，以限制有 缺陷干扰颗粒 (defective interfering particles, DIP) 的产生。
图1：BEVS/IC上游工艺三阶段，细胞培养、病毒扩增和蛋白生产
01
昆虫细胞
作为杆状病毒的受体细胞，目前常用的昆虫细胞系有草地夜蛾细胞系 (Spodoptera frugiperda cell line, Sf) 和粉纹夜蛾细胞系 (Trichoplusia ni cell line, Tn) 以及商品化High Five (H5) 细胞。Sf21是最早应用于杆状病毒表达系统的昆虫细胞系，其分离株Sf9也是目前最常用于重组蛋白表达的细胞系。有实验表明，Sf21在杆状病毒的扩增中表现好于H5，而H5更适用于蛋白的表达。另外，通过基因工程技术对野生型细胞系进行改造，开发出了可加强其糖基化复杂程度的Mimic Sf9，以及通过RNAi技术对细胞周期进行调控，从而改善蛋白表达等。在整个上游工艺过程中，昆虫细胞的活率应维持在90%以上，同时为了保证基因稳定性，传代次数最好控制在70代以内。
02
培养参数的建立
温度：昆虫细胞的培养温度一般控制在 26-29℃，最适培养温度为 27℃，在此温度下细胞的最大生长速率 0.029-0.039/h，倍增时间 18-24h。另外，在病毒扩增和蛋白生产阶段也会对培养温度进行优化。
通气：溶氧 (DO) 控制对昆虫细胞培养至关重要，DO饱和度控制在 30-100%，昆虫细胞在培养过程中耗氧量巨大，目前已知Sf9和H5昆虫细胞的比耗氧率比CHO细胞分别高出4倍和13倍，感染后会进一步增加30-40%，因此，搅拌和通气策略需要平衡细胞剪切力和气体传输效率以满足细胞的供氧需求。 CO2浓度的控制有时也很重要，作为代谢副产品，可能会抑制细胞生长和蛋白表达。
pH和渗透压：大部分昆虫细胞的 最适pH在6.0-6.4，在此范围有利于细胞的生长和代谢，因此，在整个培养过程中，需要定期监测和调节培养基的pH值。最适渗透压为 300-380 mOsm/L，渗透压对昆虫细胞的生长和增殖有着重要作用，昆虫细胞通常需要较高浓度的渗透压，所以昆虫细胞培养基中的无机盐浓度较高，且各无机盐离子之间需要平衡，如某些细胞系对Na+/K+的比例有严格要求。
二
感染过程参数的建立
昆虫杆状病毒表达载体系统是以杆状病毒作为外源基因载体，以昆虫细胞作为宿主进行基因组自我扩增与目的蛋白的表达，其中最常用的杆状病毒是从苜蓿环纹夜蛾中分离出的苜蓿蠖核型多角体病毒 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV) 。昆虫杆状病毒表达载体需要质粒载体和野生型杆状病毒整合成含有外源基因的重组杆状病毒才能实现外源基因的表达，常用的商业化重组杆状病毒构建系统有Bac-to-Bac表达系统等。BEVS/IC系统生产VLP上游工艺中的病毒Stock制备和VLP生产，都是通过重组杆状病毒对昆虫细胞的感染实现的，感染过程中有几个重要参数包括 MOI(multiplicity of infection) 、 TOH(time of Harvest) 和 CCI(cell concentration at infection) 等。
01
MOI
最佳MOI通常取决于目标产品（基于单一或多种蛋白的VLP）和生产策略（单一或合并感染）。在感染阶段，应尽可能减少DIP的干扰，避免营养限制和有毒副产物的积累。
低MOI：当MOI小于1时，只有一小部分细胞被病毒感染，未感染的细胞继续生长，随着原代病毒产生的子代病毒的增加，所有的活细胞都被病毒感染。该策略的优点是用小体积的virus stock就能开始生产，并使用较低的CCI，但也会导致培养过程中异质性细胞的产生，影响蛋白表达稳定性。低MOI可以减少DIP的产生，因此在virus stock制备阶段，通常会选择较低的MOI。
高MOI：当MOI大于1时，所有细胞被同步感染，因此，在VLP的生产阶段可采用此策略，从而提高VLP的产率。但由于感染后细胞不再生长，因此也需要更高的CCI。
02
CCI
在昆虫细胞培养过程中，细胞密度效应会限制细胞密度，但通过补料的添加可以提升细胞密度。随着CCI的增加，糖酵解和TCA循环会被下调，所以在细胞被感染后，氧气的摄入也会减少，导致细胞特异性产率减低。因此， 选择合适的CCI，可以最大限度的提高生产率，并且避免细胞密度效应的影响。
03
TOH
BEVS/IC的重组表达和VLP产量高峰通常在感染后48-72小时，根据不同的MOI等工艺参数的不同， 选择合适的TOH，保证收获到高质量的目的蛋白。
三
昆虫培养基
细胞培养基既为细胞提供了生长和繁殖的生存环境，也提供了细胞生长和增殖过程中所需的营养物质。 细胞培养基对昆虫细胞生长和VLP产量具有很大影响，因此细胞培养基的筛选是BEVS/IC系统进行VLP生产上游工艺中的重要部分。
早期昆虫培养使用Grace’s昆虫培养基等，其中需要添加10%的胎牛血清，由于胎牛血清批次间存在一定的差异，从而限制在工艺中的使用，随着无血清培养技术的发展，目前已有多种商业化的无血清培养基可用于昆虫细胞的培养。通常，商业化无血清培养基中含有多种成分，其复杂的成分组成是确保细胞生产出一致性重组蛋白的关键因素。根据培养细胞种类和工艺的不同，细胞在培养阶段和蛋白产出阶段的营养成分消耗也会有所不同，如 图2所示，比较了不同商业化昆虫培养基在表达重组VLP之间的差别，由此可见， 筛选合适的昆虫培养基是在上游工艺开发中需要重点考量的因素之一。
图2：不同市售商业化培养基培养High Five的对比数据
四
Cytiva HyClone昆虫无血清培养基
HyClone SFM4Insect培养基是一款不含动物源的无血清培养基，适合多种昆虫细胞的培养，如 Sf9、Sf21、High Five (T.ni) 和D.mel-2 cells，适应性驯化需求极低，支持细胞高密度生长和重组蛋白的高表达，SFM4Insect已经成功地在各种培养系统中进行了测试，包括T瓶、摇瓶、各种传统和一次性生物反应器，适用于BEVS生产各种重组蛋白，可提供瓶装、袋装或定制包装的液体或干粉形式。
HyClone SFX-Insect也是一款适用于多种昆虫细胞培养的无血清培养基，此款培养基采用专有配方，含有特定脂类以增强稳定性，可以支持高密度细胞培养和高效蛋白生产。如图3所示，比较了两种培养基在培养Sf9时细胞的生长情况。
图3：Sf9细胞在批培养工艺中的生长曲线
除了基础培养基外，HyClone还提供多种补料培养基， Cell Boost 6是一款化学成分限定，不含动物源和水解物的补料培养基，其含有氨基酸、脂类、生长因子等多种营养成分，可以和昆虫培养基搭配使用，从而提升细胞培养性能。
参考文献
[1]. Cox, M.M.J. Innovations in the Insect Cell Expression System for Industrial Recombinant Vaccine Antigen Production. Vaccines 2021, 9,
1504．
[2]. Palomares, L.A.; Realpe, M.; Ramírez, O.T. An Overview of Cell Culture Engineering for the Insect Cell-Baculovirus Expression Vector System (BEVS). In Methods in Molecular Biology; Humana Press: Totowa, NJ, USA, 2015; Volume 5, pp. 501–519.
[3]. Process development for pandemic influenza VLP vaccine production using a baculovirus expression system；Lai et al. Journal of Biological Engineering (2019) 13:78.
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