桃红四物汤（Taohong Siwu Decoction ，TSD ）是国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录（第一批）》第97 号方剂[1] ，是最早公布经典名方关键信息的7 首方剂之一[2] 。该方剂出自清代柴得华所著《妇科冰鉴》，由酒地黄、酒当归、酒白芍、生川芎、燀桃仁（研泥）、酒红花组成，具有养血、活血、逐瘀功效，主治血虚血瘀证[3] 。生地黄清热凉血、养阴生津，当归补血活血，酒炙增强活血作用，二者共为君药；川芎活血行气、祛风止痛，白芍酒炒后长于养血活血，桃仁、红花活血祛瘀，四者均为臣药[3-4] ；6 药配伍补中有行，破中有收，补而不滞，行而不伤，共凑活血祛瘀之功，桃红四物汤为活血化瘀代表方。
随着桃红四物汤古代经典名方制剂的研究开发，其临床应用和基础研究也成为热点。研究表明桃红四物汤活血化瘀具有改善血流动力学、血液流变学、微循环障碍，抑制血小板聚集活化等作用[5-6]，在临床治疗缺血性脑卒中[7]、冠心病[8]、心肌梗死[9]、静脉血栓[10]等血栓性疾病方面具有良好疗效。血栓性疾病具有较高致残率和病死率，血栓形成也是引发心血管血栓性疾病的主要病理过程[11]，抗血栓治疗是预防和治疗心血管血栓性疾病的重要策略[12-13]。课题组前期研究表明桃红四物汤可抑制血栓模型小鼠尾血管、肝血管、肺血管等不同部位的血栓形成，抑制血小板氧化应激，提高血小板超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，SOD ）的活性，显著降低血清炎症因子［白细胞介素-6 （interleukin-6 ，IL-6 ）、IL-1β 、肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α ，TNF-α ）］的表达等[14] ，但其活血化瘀抗血栓的作用机制和药效物质基础还不清楚。
血栓形成与炎症反应、氧化应激、细胞多种信号调控、内皮细胞、血小板和白细胞活化等多种生物过程相关[15-17]。中药复方具有“多成分、多靶点、多途径”的特点，其药效作用是多种化学成分生物效应协同参与的结果[18]。随着网络药理学、系统生物学、机器学习等生物信息技术的发展和普及，在系统观念和整体网络背景下探究中药复方的治病机制成为可能。机器学习中的重启随机游走（random walk with restart，RWR）算法常用于图论和网络分析，可模拟网络中的随机游走过程，控制重启概率来调整游走行为，矩阵运算计算每个节点与起始节点之间的得分向量[19-20]。RWR算法考虑多个替代路径和蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的全局拓扑结构，相比其他算法，其在一定程度上实现了精度的预测，应用于中药研究可以评估中药、成分群对疾病网络的影响程度，实现成分群到中药、复方的量化分析，有助于理解中药成分群协同参与疾病生物网络的作用机制[21]。
本研究以中医整体观念为指导，中药成分群为核心，疾病生物网络为切入点，整合中药网络分析、机器学习等技术，构建多层次生物网络探析桃红四物汤成分群协同抗血栓作用机制[22] 。研究通过RWR 算法构建“中药- 成分群- 成分- 基因- 生物过程- 疾病”网络，解析桃红四物汤药味配伍、成分群协同与血栓之间的潜在生物学联系，探究桃红四物汤抗血栓的潜在作用机制，为临床桃红四物汤联合化学药抗血栓的基础研究提供新方向。
1 方法
1.1 桃红四物汤活性成分群分类及靶标基因获取
结合课题组前期基础及相关文献报道[3,23] ，收集桃红四物汤各单味药炮制后的主要成分，通过中药系统药理学数据库与分析平台［TCMSP ，https://www.tcmsp-e.com/ ，设置口服生物利用度oral bioavailability ，OB ）≥30% 、类药性（drug-likeness ，DL ）≥0.18 ］、本草组鉴数据库（HERB ，http://herb.ac.cn/ ）、瑞士靶标预测数据库（SwissTargetPrediction ，http://swisstargetprediction. ch/ ）、中药分子机制的生物信息学分析数据库［BATMAN-TCM ，http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php ，设置“药物- 基因”间相似性得分scorecutoff≥20，调整后P值（adjusted P value，Padj）＜0.05 ］，获取桃红四物汤各味药活性成分及对应靶标基因，将成分靶标基因输入UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/ ，物种选择为智人“homo sapiens ”）进行校准，并将成分划分为不同成分群用于后续研究。
1.2 血栓生物过程聚类分析
以“血栓”“血栓形成”为关键词，检索人类 基因数据库（Genecards，https://genealacart.genecards. org/ ，score ＞10 ）、人类孟德尔遗传综合数据库（OMIM ，https://www.omim.Org/ ）、比较毒物基因组数据库（CTD ，https://ctdbase.org/ ，score ＞60 ）、药物银行数据库（DrugBank ，https://www.drugbank. Ca/ ），收集血栓相关基因。用Metascape 平台（https://metascape.org/ ）进行基因本体论（gene ontology ，GO ）生物过程（biological process ，BP ）富集，得到血栓相关基因的生物过程，通过Cytoscape 3.9.1 软件将其聚类为不同生物过程[24] 。
1.3 桃红四物汤抗血栓生物过程富集及协同作用初步分析
将收集的酒当归、生川芎、酒地黄、酒白芍、燀桃仁、酒红花6 味中药与成分群的靶标基因分别导入Metascape 平台进行GO 的生物过程富集，对比中药、成分群富集排名前20 的GO 生物过程与血栓聚类生物过程，初步分析中药、成分群抗血栓相关生物过程的协同作用。
1.4 基于RWR算法和生物过程网络的桃红四物汤成分群协同抗血栓定量分析
首先采用RWR 算法[25-26] 计算桃红四物汤各组（复方、单味药与成分群）与随机对照组［从uniport 导出的20 270 个人类基因中通过IBM SPSS Statistics 25 随机抽取100 组（每组包含1 000 个基因）作为随机对照组］对血栓PPI 背景网络影响的得分向量，以及血栓不同生物过程对血栓PPI 背景网络影响的得分向量；再将桃红四物汤各组、随机对照组与血栓不同生物过程的得分向量进行Pearson 相关性分析，最后将所得Pearson 相关系数进行Z 得分（Zscore ）显著性分析，以Zscore 衡量不同对象对血栓生物过程网络的显著性影响，综合分析复方与各单味药的Zscore ，以复方和单味药对血栓生物过程的Zscore 总分的平均数、中位数为标准，筛选桃红四物汤抗血栓关键生物过程；基于关键生物过程分析各成分群的Zscore 判断成分群对各类生物过程的显著性及成分群之间的协同作用，筛选关键成分群。
1.4.1RWR 得分向量计算将血栓相关基因导入STRING 在线平台（https://stringdb. org/ ）得到血栓PPI 网络，并作为背景网络以血栓不同生物过程的基因为种子节点，利用RWR 算法计算血栓不同生物过程影响背景网络的得分向量（disease scores ）。同理，以桃红四物汤各组靶标基因为种子节点，用RWR 算法计算桃红四物汤各组、随机对照组影响P 背景网络的得分向量（drug scores ）。
t为游走次数；P 为加权PPI 网络的列标准化邻接矩阵，表示网络中2 个节点之间的连接强度；x0 为种子节点强度的初始向量；r 为重启概率，本研究重启概率设置为默认值0.75
1.4.2Pearson 相关性分析基于“1.4.1 ”项中得到的disease scores 和drug scores ，通过IBM SPSS Statistics 25 计算桃红四物汤各组和血栓各生物过程之间的Pearson 相关系数，以量化受血栓生物过程影响和受桃红四物汤各组影响的血栓PPI 背景网络重合程度，衡量桃红四物汤各组对血栓生物过程作用的影响，通过IBM SPSS Statistics 25 计算桃红四物汤各组和血栓各生物过程之间的Pearson 相关系数。将随机对照组作为种子集，运行RWR 算法，重复100 次以产生参考扰动分布，得到随机对照组的得分向量，并计算随机对照组和血栓各生物过程之间的Pearson 相关系数。
cor代表Pearson 相关系数，Scores 代表基因的网络影响得分
1.4.3Zscore 显著性分析Zscore 用于衡量桃红四物汤各组对血栓生物过程的影响与随机对照组之间的差异，判断桃红四物汤是否对血栓生物过程的影响具有显著性。Zscore 的绝对值大于3 具有统计学意义，Zscore 越高显著性越强，桃红四物汤与随机对照组对血栓生物过程影响的差异性越大。综合分析复方与各单味药的Zscore ，以复方和单味药对生物过程的Zscore 总分的平均数、中位数为标准，筛选桃红四物汤抗血栓关键生物过程；基于关键生物过程分析各成分群的Zscore ，筛选关键成分群。
Zscore ＝(相关性－µ相关性)/σ相关性
μ相关性和σ 相关性分别表示随机对照组相关系数的均值和标准差
1.5 桃红四物汤关键成分群协同抗血栓关键生物过程网络构建
将“关键成分群- 关键生物过程”交集靶点导入STRING 在线平台，设置物种为“Homo sapiens ”，获取PPI 网络数据，通过Cytoscape 3.9.1 软件运行MCODE 算法提取交集靶点的核心子网络，并结合CytoHubba 中最大团中心算法（maximal clique centrality ，MCC ）、最大邻域分量算法（maximum neighborhood component ，MNC ）、最大邻域组件密度（density of maximum neigh‐borhood component ，DMNC ）、综合度（degree ）、瓶颈中心性（BottleNeck ）5 种算法筛选排名前10 的靶点作为关键靶点；采用Network Analyze 算法，以degree 值≥5 为标准，通过“成分群- 成分- 靶点”网络构建筛选成分群的关键成分，最后绘制“关键成分- 关键靶点- 关键生物过程”PPI 网络。
1.6 分子对接
对“1.5 ”项中得到的关键成分与关键靶点进行分子对接，以结合能判断结合的稳定性，进一步筛选核心靶点与核心成分。在RCSB 数据库（https://www.rcsb.org/ ）中下载关键靶点的PDB 结构文件，通过PubChem 数据库（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/pccompound ）获取关键成分的3D SDF 结构文件，利用CB-Dock2 网站（https://cadd.l abshare.cn/cb-dock2/php/index.php ）对蛋白质进行去水分子、去金属离子并进行自动对接，结合能越小，亲和力越好，结合越稳定。
2 结果
2.1 桃红四物汤活性成分群分类及靶标基因获取
从桃红四物汤中筛选出33个活性成分（表1），其中当归13个、川芎11个、地黄7个、白芍6个、桃仁6个、红花7个，各单味药靶标基因数量分别是415、305、112、302、414、336个，去重后6味中药靶标基因有715个。将33个活性成分归属为9类成分群（图1），包括有机酸类、香豆素类、苯酞类、黄酮类、环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、萜类、氰苷类、生物碱类，各类成分群靶标基因数量分别是306、147、171、276、33、41、107、76、62个。
2.2 血栓生物过程聚类分析
共收集血栓相关基因1 040 个，将1 040 个基因导入Metascape 平台通过GO 生物过程富集到140 个生物过程，在Cytoscape 软件上进行聚类分析（图2 ），根据生物过程相关性聚类为细胞活化（34 个）、炎症反应（21 个）、氧化应激（24 个）、细胞内信号传导（33个），其中1 040个血栓相关基因聚类到细胞活化469个、炎症反应454个、氧化应激389个、细胞内信号传导483个。
2.3 桃红四物汤抗血栓生物过程富集及协同作用初步分析
将桃红四物汤中药、成分群靶标基因分别导入Metascape 平台进行GO 生物过程富集分析，取各单味药及成分群排名前20 的GO 生物过程与血栓聚类生物过程进行对比。从中药层面分析发现，桃红四物汤6 味中药均参与血栓4 类生物过程（图3 ），各味中药作用于血栓4 类生物过程出现的频次分别为11 （红花）、9 （白芍）、9 （桃仁）、9 （川芎）、8 （当归）、7 （地黄）。
从成分群层面分析发现，参与调节炎症反应的成分群包括黄酮类、香豆素类、萜类等7 个，参与调节氧化应激的成分群包括黄酮类、氰苷类、生物碱类等7 个；参与调节细胞内信号传导的成分群包括生物碱类、有机酸类、黄酮类等7 个；参与调节细胞活化的成分群包括苯酞类、萜类、有机酸类等6 个。各类成分群之间既有共同作用的生物过程类别又各有侧重（图4 ）。有机酸类、香豆素类、萜类均作用于血栓4 类生物过程；黄酮类作用于炎症反应、氧化应激、细胞内信号传导；生物碱类作用于细胞活化、氧化应激、细胞内信号传导；苯乙醇苷类作用于细胞活化、炎症反应、细胞内信号传导；氰苷类作用于炎症反应、氧化应激、细胞内信号传导；苯酞类作用于细胞活化、炎症反应；环烯醚萜苷类仅作用于氧化应激。
初步分析发现桃红四物汤6 味中药、成分群协同广泛参与血栓4 类生物过程，红花、白芍、桃仁、川芎是其抗血栓的主要药味，各类成分群中有机酸类、香豆素类、萜类最为主要，而环烯醚萜苷类的作用相对不明显，炎症反应、氧化应激、细胞内信号传导是桃红四物汤成分群抗血栓更为主要的生物过程，而成分群对细胞活化的作用则相对较小。
2.4 基于RWR算法和生物过程网络的桃红四物汤成分群协同抗血栓定量分析
进一步采用RWR 算法分析成分群协同对血栓生物过程的影响，通过Pearson 相关性分析发现桃红四物汤与血栓相关性强（表2 ）。Zscore 显著性分析发现，桃红四物汤、单味药与随机对照差异明显，复方及单味药Zscore均大于4，具有统计学意义，表明桃红四物汤抗血栓具有显著性，各味药配伍协同发挥抗血栓作用的显著性大小依次为白芍＞桃仁＞红花＞川芎＞当归＞地黄（表3和图5）。从成分群Zscore可知，有机酸类、黄酮类、生物碱类、苯乙醇苷类在细胞活化中Zscore均大于4，有机酸类得分最高；黄酮类、有机酸类、生物碱类、苯乙醇苷类、萜类在炎症反应中Zscore均大于4，黄酮类得分最高；黄酮类、有机酸类、生物碱类、苯乙醇苷类、萜类、香豆素类、苯酞类在氧化应激中Zscore均大于4，黄酮类得分最高；黄酮类、有机酸类、生物碱类、苯乙醇苷类、萜类、苯酞类在细胞内信号传导中Zscore均大于4，黄酮类得分最高（表3、图6）。综合分析桃红四物汤及单味药对血栓4类生物过程的Zscore，结果显示氧化应激＞炎症反应＞细胞内信号传导＞细胞活化；以桃红四物汤和单味药对生物过程的Zscore总分的平均数、中位数为标准，其中氧化应激与炎症反应的Zscore总分大于该标准，推断氧化应激和炎症反应是桃红四物汤发挥抗血栓作用的关键生物过程。以Zscore大于4为标准，基于关键生物过程分析不同成分群的Zscore，发现黄酮类、有机酸类、生物碱类、苯乙醇苷类、萜类对氧化应激、炎症反应均具有显著性，香豆素类、苯酞类主要对氧化应激具有显著性。因此推断桃红四物汤中黄酮类、有机酸类、生物碱类、苯乙醇苷类、萜类、香豆素类、苯酞类可作为关键成分群协同作用于血栓关键生物过程发挥抗血栓作用。
2.5 桃红四物汤关键成分群协同抗血栓关键生物过程网络构建
基于“2.4 ”项中筛选出的2 类关键生物过程与7 类关键成分群（其中根据“2.4 ”项结果可知香豆素类、苯酞类主要对氧化应激具有显著性，故仅开展香豆素类、苯酞类与氧化应激的PPI 分析）分别开展PPI 网络分析。在血栓炎症反应中，通过“成分群（5 个）- 炎症反应”网络筛选得到25 个关键靶点、7个关键成分；在血栓氧化应激中，通过“成分群（7个）-氧化应激”网络筛选得到27个关键靶点、7个关键成分（表4）。综合分析后初步认为桃红四物汤关键成分群主要通过10个关键成分（儿茶素、没食子酸、绿原酸、川芎哚、对香豆酸、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、亚麻酸、毛蕊花糖苷）作用于40个关键靶点协同改善炎症反应与氧化应激发挥抗血栓作用（图7）。
2.6 分子对接
将筛选得到的10 个关键成分与40 个关键靶点进行400 次分子对接，分子对接结合能的聚类热图如图8 所示，10 个关键成分和40 个关键靶点的对接结合能均＜0 kcal/mol （1 kcal/mol ＝4.2 kJ/mol ），表明筛选出的关键成分能够自发地与关键靶点结合。其中，川芎哚、儿茶素、绿原酸、毛蕊花糖苷、羟基红花黄色素A 、芍药苷与40 个关键靶点的结合能均≤−5 kcal/mol ，具有较高的结合亲和力，推测川芎哚、儿茶素、绿原酸、毛蕊花糖苷、羟基红花黄色素A 、芍药苷是桃红四物汤成分群协同抗血栓氧化应激与炎症反应的核心成分；肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor ，TNF ）、核DNA 结合蛋白高迁移率组盒1 （high mobility group box 1 protein ，HMGB1 ）、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 （nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 ，NLRP3 ）、多聚ADP 核糖聚合酶1 （poly ADP-ribose polymerase-1 ，PARP1 ）、过氧化物酶体增殖物激活受体α （peroxisome proliferator-activated receptor alpha ，PPARA ）、磷酸甘油醛脱氢 酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH ）、基质金属蛋白酶9 （matrix metalloproteinase 9 ，MMP9 ）、干扰素（interferon gamma ，IFNG ）、白细胞介素17A （interleukin 17A ，IL17A ）、原癌Ras 基因（harvey Ras ，HRAS ）与川芎哚、儿茶素、绿原酸、毛蕊花糖苷、羟基红花黄色素A 、芍药苷的结合能均≤−6 kcal/mol ，推测它们是桃红四物汤成分群协同抗血栓氧化应激与炎症反应的核心靶点（表5 ）。
分子对接结果在“关键成分- 关键靶点”的基础上进一步分析得到成分群发挥协同作用的“核心成分- 核心靶点”，推测桃红四物汤主要通过川芎哚、儿茶素、绿原酸、毛蕊花糖苷、羟基红花黄色素A 、芍药苷6 个核心成分协同作用于TNF 、HMGB1 、NLRP3 、PARP1 、PPARA 、GAPDH 、MMP9 、IFNG 、IL17A 、HRAS 10 核心靶点，参与炎症与氧化应激2 个生物过程发挥抗血栓作用。6 个核心成分与10个核心靶点分子对接结合能绝对值前10的受体-配体组合分别是毛蕊花糖苷和HMGB1、毛蕊花糖苷和GAPDH、毛蕊花糖苷和NLRP3、羟基红花黄色素A和IFNG、芍药苷和GAPDH、毛蕊花糖苷和IL17A、绿原酸和GAPDH、川芎哚和PARP1、儿茶素和MMP9、儿茶素和PARP1（图9）。
3 讨论
血栓形成是一种常见的病理过程，由血小板活化和凝血因子活化引起流动血液凝固导致，内皮损伤、血流状态异常和高凝状态是诱发血栓形成的三大因素[13] 。目前临床常用的抗血栓药物主要包括溶栓药物、抗凝药物、抗血小板药物和他汀类药物，但这些药物存在出血风险增加、药物不耐受、药物抵抗且疗效单一等问题，限制临床血栓治疗[27-28] 。中医药因其多成分、多靶点、多途径以及较为安全的特点，近年来逐渐被人们关注，现代临床及基础研究发现，活血化瘀中药在抗血栓方面疗效显著，活血化瘀中药与化学药联合抗血栓治疗已经成为中西医结合抗血栓研究最为活跃、成就最为显著的领域。桃红四物汤是临床中西医结合抗血栓的有效治疗措施[29-30] ，但其活血化瘀抗血栓的分子机制尚不清楚，药效物质基础也没有完全阐明。
本研究以中医整体观念为指导，通过血栓生物过程网络聚类、中药配伍与成分群协同分析，结合RWR 算法定量分析筛选桃红四物汤抗血栓的关键生物过程与关键成分群，层层递进，逐步深入解析桃红四物汤抗血栓的科学内涵。研究结果推测桃红四物汤主要通过6 个核心成分（川芎哚、儿茶素、绿原酸、毛蕊花糖苷、羟基红花黄色素A 、芍药苷）协同作用于10 个核心靶点（TNF 、HMGB1 、NLRP3 、PARP1 、PPARA 、GAPDH 、MMP9 、IFNG 、IL17A 、HRAS ）参与炎症与氧化应激2 个生物过程发挥抗血栓作用（图10 ），为活血化瘀方桃红四物汤联合化学药抗血栓研究提供方向。
查阅大量文献分析核心成分、核心靶点与血栓之间的关系，发现现代研究已明确了6 个核心成分对血栓的重要作用。川芎哚具有一定程度的抗凝血、降低血液黏度和红细胞聚集、改善血液流变学及轻度增强红细胞变形的功能[31] 。儿茶素可以稳定活性氧，减少氧化应激物的产生，防止脂质过氧化、调节脂质代谢、保护血管内皮等[32] 。绿原酸可以降解血凝块，抑制促凝血蛋白酶、凝血酶、活化因子（FXa、FXIIIa）的酶活性，延长活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和凝血酶时间[33] ；抑制氧化应激、白细胞浸润、血小板聚集、血小板-白细胞相互作用、血管重塑和细胞凋亡，调节心血管系统中的葡萄糖和脂质代谢和血管舒张[34] 。毛蕊花糖苷可以抑制动脉粥样硬化大鼠炎症和氧化应激，改善脂质代谢和血管内皮功能[35] 。羟基红花黄色素A可以抑制二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）诱导的血小板聚集，改善血浆黏度、全血黏度等相关血液流变学指标，延长大鼠凝血酶时间[36] ；抑制兴奋性毒性、改善氧化应激、抑制炎症和细胞凋亡，具有抗炎、抗氧化、抗凝作用[37] 。芍药苷可以调节葡萄糖和脂质代谢，发挥抗炎、抗氧化应激和抗动脉粥样硬化活性[38] 。
氧化应激也是桃红四物汤抗血栓的关键生物过程。氧化应激参与多种血栓性疾病的病理过程，其诱发的血管损伤是影响各种心血管疾病的关键因素[52] 。有报道称PARP1 在氧化应激诱导的血管损伤中起着至关重要的作用，心血管疾病研究中观察到PARP1 的高表达，PARP1 是作为氧化应激诱导的心血管损伤的主要因素[53] 。PPARA 是一种核受体，在调节脂质代谢和炎症反应等多种血管病理过程中起着至关重要的作用，血管平滑肌细胞中PPARA 的上调可抑制表型转换和氧化应激，改善血管紧张素II （angiotensin II ，ang II ）诱导的ROS 产生和血管重塑[54] 。HRAS 是RAS 家族蛋白，与血小板整合素激活的调节有关，可间接调节血小板聚集和血栓的形成[55] 。
本研究聚焦活血化瘀方桃红四物汤抗血栓生物过程网络，解析“中药-成分群-成分-基因-生物过程- 疾病网络”之间的关系，揭示血栓发生、发展的生物学基础与关键机制，预测桃红四物汤抗血栓相关生物过程的核心成分、核心靶点。后续将考虑针对成分群协同抗血栓关键生物过程的核心成分与核心靶点开展进一步的实验研究，对桃红四物汤中成分及各成分相互作用、配伍变化及不同含量进行药效学实验和分子生物学实验，深入研究其抗血栓作用，为活血化瘀方桃红四物汤联合化学药抗血栓研究提供方向。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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