张硕，阚俊虎，周家伟，武志强
线粒体是由内共生于真核细胞祖先的古细菌进化而来，作为半自主细胞器，具有独立于核基因组的 线粒体DNA（mtDNA）。线粒体在与宿主共进化的过程中转移和丢失了大部分基因，保留下来与呼吸作用等相关的基因，成为细胞的能量和代谢中心。 关于线粒体功能基因的挖掘有待继续深入的进行。由于线粒体产生大量自由基，具有极高诱变潜力的内部环境，同时动物mtDNA在连续复制过程中碱基错误掺入率是核基因组的103-104倍。因此，在两侧对称动物中观察到mtDNA突变率估计值达到核基因组9-25倍的现象。在人类和哺乳动物中发现，线粒体变异在某些最常见的与年龄相关疾病中发挥重要作用。氧自由基清除剂被用于抑制线粒体疾病中活性氧上升的影响，但是这些药物治疗也面临着耐药性等问题。基于基因工程的线粒体替代疗法（MRT）, 由于线粒体的主要供体来自第三人，属于“三亲婴儿”，安全性和伦理存在潜在问题。另外一种治疗方法是选择性地消除突变的mtDNA，早期方法依赖突变mtDNA中的限制性酶切位点，只能适用于某些突变类型治疗。随着基因编辑技术的发展和在线粒体基因组中的快速应用，这种直接修饰突变mtDNA的技术展示出治疗线粒体疾病的潜力。因此，有关人的线粒体基因组编辑的研究非常火热。
与动物mtDNA相比，由于内含子和基因间序列的增加（平均占基因组72%），植物mtDNA大小在66 kb-12 Mb。由于存在大量重复序列和高度活跃的重组活动，陆地植物mtDNA具有频繁的结构重组。与动物mtDNA保守紧凑的基因组结构不同，大多数陆地植物mtDNA的构象因基因间区重复序列介导的重组呈现出环状、线状和多分支分子等状态，甚至在植物不同发育时期发现不同的mtDNA构象。但其编码基因的突变率远低于细胞核基因组和动物mtDNA，这种高重组率和编码区低突变率的现象被称为“进化悖论”。 在植物mtDNA中序列突变和结构变异可能影响农作物产量、抗性和育性等关键性状相关基因功能，同时大量非编码区序列的功能亟需更加精细的挖掘研究。在动物线粒体编辑技术应用于植物领域之前，植物线粒体基因功能的研究还局限于异源过表达或核转化后蛋白产物靶向导入线粒体的方式来进行间接验证。因此针对植物线粒体基因组的直接编辑研究还属于一片蓝海领域。
近日， 《生物技术通报》在线 发表了中国农业科学院深圳农业基因组研究所 武志强团队题为 》的文章。本文综述了目前应用广泛的线粒体编辑工具发展以及在植物领域的线粒体编辑研究进展，展望了植物线粒体编辑技术未来的优化及应用潜力。
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本文主要包括以下几部分内容：
1 线粒体基因组编辑技术
1.1 mitoZFN
1.2 mitoTALEN
1.3 线粒体单碱基编辑技术
1.4 基于CRISPR/Cas系统的线粒体编辑技术
2 植物线粒体基因组编辑
2.1基于TALE的植物线粒体基因组编辑技术
2.2 mitoCRISPR/Cas9技术介导的植物线粒体基因组编辑
3结语与展望
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有多项独立的研究在基于TALE的线粒体编辑工具的使用过程中观察到广泛核基因组脱靶现象，虽然MTS可以行使线粒体靶向的作用，但不可避免的存在编辑工具向核内的转运。根据mitoZFN的优化思路，向TALE与核酸酶/脱氨酶的复合体下游增加NES，可能提高复合体向线粒体的转运同时降低对核基因组的损伤。 在陆地植物的应用中mitoTALEN利用的仍然是同源Fok I酶，考虑到植物线粒体基因组中具有更多高度相似的序列，利用异源二聚体Fok I酶替换同源的Fok I酶可能进一步降低线粒体基因组上的脱靶率。
基于TALE或ZF的线粒体单碱基编辑工具的迅速发展得益于脱氨酶的不断更新，研究人员通过利用人工智能（AI）辅助挖掘新型脱氨酶，以及不同酶的组合开发了一系列具有特殊优势的碱基编辑工具。在线粒体编辑技术不断接近临床要求的过程中应提高脱氨酶编辑效率，减小旁观者效率引起的脱靶率以及减小对核基因组的损伤。
具有设计简单、省时以及经济等优势的 CRISPR/Cas如果实现在线粒体编辑中的高效工作，会为未来线粒体相关疾病建模和基因治疗提供强有力工具。 sgRNA向线粒体内的有效运输是CRISPR/Cas在线粒体编辑应用的最大障碍。虽然线粒体在不断的输入和输出各种RNA，然而关于RNA如何运输到线粒体内的认识很有限。近期一项鉴定到首个哺乳动物RNA转运通道的研究，可能为提高RNA向线粒体内的运输提供思路。 通过分析和总结靶向线粒体tRNA、rRNA的结构特征，指导修饰sgRNA结构或将rRNA作为载体，提高sgRNA进入线粒体的潜力，推动CRISPR/Cas在线粒体编辑的应用。
陆地植物线粒体基因组上有90%以上的序列为非编码区。由于缺乏线粒体基因组遗传转化技术，大量的未知序列没有进行功能解析，这些未知序列可能是由于线粒体基因组重排产生的嵌合基因（如典型的CMS相关基因）及其它未知功能的保守序列。 随着各种线粒体基因组编辑技术的兴起，这些非编码区上未知序列的功能及存在意义有待探明。这些技术的出现为直接研究植物线粒体基因组的功能，尤其是为研究植物线粒体基因组上的未知序列功能提供了极大契机。在模式植物线粒体基因组中进行广泛大量的未知序列编辑，一方面，对线粒体基因组上的未知保守序列（潜在的CMS基因）进行功能和分子机制的解析，以探明其功能和表型关联的潜在意义；另一方面，挖掘线粒体基因组在进化上保守的功能序列，为线粒体基因组非编码区序列的进化变异提供功能上的解析。在此基础上指导对植物线粒体基因组的改造，进而推动线粒体基因组在作物改良中的应用。 返回搜狐，查看更多
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