鬼臼毒素（podophyllotoxin ）是一种存在于小檗科的八角莲属、桃儿七属和山荷叶属等多种植物中，具有多种生理活性的芳基四氢萘型木脂素[1] 。研究表明，鬼臼毒素具有抗癌、抗菌、抗炎、抗病毒等多种生理活性，其中抗肿瘤表现最为出色[2-4] 。然而，鬼臼毒素存在的水溶性低、靶向性差、对正常细胞和肿瘤细胞无差别杀伤、对机体产生严重的不良反应等问题，严重阻碍了其应用[5] 。为了解决上述问题，构建活性氧响应型纳米递药系统可能是一个有效策略。活性氧响应型纳米胶束，能够利用肿瘤组织中的高浓度活性氧这一特性，实现药物的精准释放[6] 。纳米胶束具有“核-壳”结构，其中亲脂性的内核可以包载水溶性差的药物，亲水性的外壳可以增加药物在水中的溶解度[7] 。此外，通过在纳米胶束表面修饰合适的靶向配体，可以赋予其主动靶向性，将治疗药物精准地送至目标部位[8] 。
基于此，本研究采用薄膜水合法制备了活性氧响应型透明质酸修饰的鬼臼毒素胶束（reactive oxygen species-responsive hyaluronic acid-modified podophyllotoxin micelles ，HA-oxi-Ms/Pod ）。在HA-oxi-Ms/Pod 中，聚乙二醇5000 （PEG5000 ）位于最外层，形成水化层，以增强胶束的增强渗透和滞留（enhanced permeability and retention ，EPR ）效应，同时隐藏主动靶向配体透明质酸，以减少正常细胞对胶束的摄取、减轻不良反应[12] 。当胶束到达肿瘤组织后，在高浓度活性氧环境下，活性氧响应键断裂，PEG5000 水化层脱落，暴露出靶向分子透明质酸，进而通过主动靶向作用增加癌细胞的摄取，如图1 所示。本研究通过Box-Behnken 设计- 响应面法（Box-Benhken design-response surface method ，BBD-RSM ）优化制剂处方工艺，并进一步对HA-oxi-Ms/Pod 的粒径、ζ电位、微观形态、卵巢癌细胞毒性、体外靶向性、抑制卵巢癌细胞侵袭能力进行考察，以期为鬼臼毒素制剂研发提供参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器
FA1004 型电子天平，上海越平科学仪器有限公司；RE52CS 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；KQ3200E 型超声波清洗器，超声功率150 W ，工作频率40 kHz ，昆山市超声仪器有限公司；Agress 1100 型高效液相色谱仪，UV 检测器，大连依利特分析仪器有限公司；Litesizer 500 型激光散射粒度仪，奥地利安东帕公司；JEM-1200EX 型透射电子显微镜（TEM ），日本JEOL 公司。
1.2 药品与试剂
人卵巢腺癌SK-OV-3 细胞，亿奥邦生物科技研究有限公司。
2 方法与结果
2.1 HA-oxi-Ms/Pod的制备
称取处方量的Soluplus 、TPGS1000 、鬼臼毒素、DSPE-PEG2000-TK-PEG5000 、DSPE-PEG2000-HA 溶于甲醇中，减压蒸干溶剂，此时圆底烧瓶底部形成一层均匀透明薄膜，向其中加入PBS ，超声水合后薄膜脱落，静置后溶液透明，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，收集滤液即得。
采用相同的方法制备不添加鬼臼毒素的空白胶束（blank-micelles ，B-Ms ），不添加DSPE-PEG2000-TK-PEG5000 和DSPE-PEG2000-HA 的鬼臼毒素胶束（Pod-Ms ），不添加DSPE-PEG2000-TK-PEG5000 的透明质酸修饰的鬼臼毒素胶束（HA-Ms/Pod ）。
2.2鬼臼毒素含量测定的方法学建立
2.2.1空白溶液的制备精密吸取1 mL 的B-Ms 和适量甲醇，置于5 mL 棕色量瓶中，超声破乳，定容至刻度，4 ℃保存，备用。
2.2.2供试品溶液的制备精密吸取1 mL 的HA-oxi-Ms/Pod 和适量甲醇，置于5 mL 棕色量瓶中，超声破乳，定容至刻度，4 ℃保存，备用。
2.2.3对照品溶液的制备精确称取10.0 mg 鬼臼毒素于100 mL 量瓶中，加甲醇定容，配制0.10 mg/mL 的鬼臼毒素对照品母液。稀释母液制成质量浓度为0.003 、0.004 、0.005 、0.008 、0.009 、0.010 mg/mL 的系列对照品溶液，低温避光保存，备用。
2.2.4 鬼臼毒素色谱条件色谱系统采用依利特高效液相色谱（HPLC ）；色谱柱为Ultimate XB-C18 （250 mm ×4.6 mm ，5 μm ）柱；以乙腈- 水（68 ∶32 ）作为流动相；体积流量1.0 mL/min ；柱温30 ℃；检测波长292 nm ；每次进样量为20 μL ；理论塔板数以鬼臼毒素峰计算为10 870 。
2.2.5 专属性考察精密吸取20 μL 的鬼臼毒素对照品溶液（0.004 mg/mL ）、供试品溶液和空白溶液，注入高效液相色谱仪进行分析，结果如图2 所示，鬼臼毒素色谱峰在3.6 min 左右出现，空白溶液无干扰，说明此色谱条件可用于该脂质体中鬼臼毒素的含量测定，该方法专属性良好。
2.2.6 线性关系考察按“2.2.4 ”项下色谱条件对“2.2.3 ”项中系列鬼臼毒素对照品溶液进样分析，以系列鬼臼毒素对照品溶液的质量浓度为横坐标（X ），对应的峰面积为纵坐标（Y ），绘制标准曲线，进行线性回归，得线性回归方程Y ＝59 804 X ＋95.873 ，R 2＝0.994 8 。结果表明，鬼臼毒素在0.003 ～0.010 mg/mL 线性关系良好。
2.2.7 精密度试验取“2.2.3 ”项下鬼臼毒素对照品溶液，同1 d 内连续进样6 次，计算日内精密度；连续进样5 d ，计算日间精密度。结果，日内精密度RSD 为0.29% ，日间精密度RSD 为0.65% ，证明该仪器精密度良好。
2.2.8 重复性试验按“2.2.2 ”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按照“2.2.4 ”项下色谱条件进行HPLC 分析，结果鬼臼毒素峰面积的RSD 为0.99% ，结果表明该方法重复性良好。
2.2.9 稳定性试验按“2.1 ”项下方法制备HA-oxi-Ms/Pod ，按“2.2.2 ”项下方法制备供试品溶液，分别在制备后0 、2 、4 、8 、12 、24 h 时进样测定，结果鬼臼毒素峰面积的RSD 为1.04% ，结果表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。
2.2.10 加样回收率试验精密吸取1 mL B-Ms 、1 mL 鬼臼毒素对照品溶液于10 mL 棕色量瓶中，加甲醇超声破乳、定容，制成供试品溶液，平行6 份，进样分析。结果鬼臼毒素的平均加样回收率为100.01% ，RSD 为0.78% ，表明该方法符合要求。
2.3 HA-oxi-Ms/Pod的处方工艺优选
2.3.1 胶束包封率的测定参考课题组之前的工作，利用HPLC 法测定胶束的包封率[13] 。取0.5 mL 胶束溶液至5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，过0.45 μm 微孔滤膜，收集滤液，得过柱前溶液。取0.5 mL 胶束溶液至葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50 0.5 mL PBS 缓冲液洗脱1 次，将2 次洗脱液合并，甲醇定容至5 mL ，过0.45 μm 微孔滤膜，收集滤液，得过柱后溶液。按照“2.2.4 ”项下色谱条件进样分析，记录过柱前、后溶液中鬼臼毒素的峰面积，根据下列公式计算胶束中鬼臼毒素的包封率。
包封率＝过柱后鬼臼毒素含量/ 过柱前鬼臼毒素含量
2.3.2 处方优选选用BBD-RSM 实验设计方法，以Soluplus 与TPGS1000 质量比（X1 ）、Soluplus 与鬼臼毒素质量比（X2 ）和水化温度（X3 ）3 个因素为自变量，以HA-oxi-Ms/Pod 中鬼臼毒素的包封率（Y ）为因变量，通过考察药物包封率Y ，对HA-oxi-Ms/ Pod 处方进行改良，得到最优处方。在前期预试验的基础上，3 个自变量设定范围：X1 0.5 ∶1 ～3.5 ∶1 ，X2 80 ∶1 ～20 ∶1 ，X3 10 ～50 ℃。实验方案与包封率测定结果见表1 。
利用Design-Expert 8.0.6.1 软件拟合方程如下：Y ＝94.720 －0.048 7 X1 ＋6.560 X2 －2.390 X3 －1.960 X1X2 －2.170 X1X3 ＋2.220 X2X3 －6.550 X12 －12.310 X22 －6.970 X32 ，R2 ＝0.996 7 ，P ＜0.05 。拟合结果表明，该实验设计可以明确地对比Y 值的大小，判定以此方法来筛选HA-oxi-Ms/Pod 的最优制备工艺，是切实可行的。方差分析结果见表2 ，结果表明因素X1 对胶束包封率Y 无显著影响（P ＞0.05），交互因素X2 、X3 对胶束包封率Y 影响极其显著（P ＜0.001），因素X1X2 、X2X3 、X1X3 对胶束包封率Y 有显著统计学差异（P ＜0.01），因素X12 、X22 、X32 对胶束包封率也有极其显著影响（P ＜0.001）；实验模型相关系数Radj2 ＝0.992 4，表明该实验模型可以很好地反应胶束包封率受3因素的影响而改变，证明用此模型来分析HA-oxi-Ms/Pod的处方可行。
使用Design-Expert 8.0.6.1 软件绘制各因素的三维效应面图和二维等高图，结果见图3 。对图表进行直观分析，根据实际情况，最终确定最优处方工艺为Soluplus 40 mg ，Soluplus 与TPGS1000 质量比2 ∶1 ，Soluplus 与鬼臼毒素质量比40 ∶1 ，DSPE-PEG2000-TK-PEG50002 mg ，DSPE-PEG2000-HA 2 mg ，水化温度30 ℃，处方量为5 mL 。
2.3.3 验证实验为了验证研究中得到的最优HA-oxi-Ms/Pod 处方是否合理，按照上述方法制备3 批HA-oxi-Ms/Pod 并测定其中鬼臼毒素的包封率，结果3 批HA-oxi-Ms/Pod 中鬼臼毒素的包封率分别为94.36% 、93.61% 、94.86% ，平均包封率为（94.28 ±0.51 ）% ，表明所选择的处方工艺可靠。
2.4 HA-oxi-Ms/Pod的体外评价
2.4.1 粒径和ζ电位向HA-oxi-Ms/Pod 溶液中添加1 mmol/L H2O2 （即得HA-oxi-Ms/Pod ＋H2O2 ），观察胶束的粒径变化与表面形貌，评价胶束的活性氧响应能力。利用激光散射粒度仪对Pod-Ms 、HA-oxi- Ms/Pod和HA-oxi-Ms/Pod＋H2O2 3种胶束的粒径、ζ电位进行测定。利用TEM观察胶束的微观形貌。实验结果如表3和图4～6所示，HA-oxi-Ms/Pod的平均粒径为（104.85±1.03）nm（图4），加入H2O2后，活性氧敏感键断裂，最外层PEG5000脱落，粒径收缩至（86.94±0.62）nm，其数值仍略大于Pod-Ms的（73.38±0.97）nm，可能是由于透明质酸修饰在胶束的表面，增加了胶束的尺寸。HA-oxi-Ms/Pod的ζ电位为（−6.40±0.43）mV（图5），加入H2O2后ζ电位升高至（−4.70±0.29）mV，而Pod-Ms的ζ电位为（−1.33±0.17）mV。TEM观察结果显示，HA-oxi-Ms/Pod呈类圆形，加入H2O2后，尺寸有所变小，并有部分胶束破裂（图6）。
2.4.2 胶束的体外释放评价利用透析袋法考察胶束的体外释放行为，释放介质为含5% 聚山梨酯80 的PBS 溶液以及含5% 聚山梨酯80 、1 mmol/L H2O2 的PBS 溶液。分别吸取1 mL 的鬼臼毒素对照品溶液、Pod-Ms 、HA-oxi-Ms/Pod ，置于截留相对分子质量为8 000 ～14 000 的透析袋中，浸于20 mL 释放介质中，将释放体系放入摇床中，于37 ℃、100 r/min振荡，分别于设定的时间点（5、10、20、30 h）取出0.5 mL释放介质，并及时补充0.5 mL新鲜的释放介质，每种制剂重复3次。利用HPLC测定各样品中鬼臼毒素的量，并计算各种制剂在各时间点的药物释放量。
体外释放率＝释放的药物量/ 总药量
实验结果如图7 所示，在第30 小时，鬼臼毒素游离药物体外释放率为（87.12 ±6.62 ）% ，Pod-Ms 体外释放率为（40.04 ±3.18 ）% ，HA-oxi-Ms/Pod 体外释放率为（35.42 ±3.91 ）% ，HA-oxi-Ms/Pod ＋H2O2 体外释放率为（80.73 ±1.82 ）% 。实验结果表明，HA-oxi-Ms/Pod 分别与含有/ 不含有H2O2 的释放介质共孵育，在30 h 内，与没有H2O2 的释放介质相比，释放介质中含有1 mmol/L H2O2 时鬼臼毒素释放率明显增加。这表明HA-oxi-Ms/Pod 中装载的鬼臼毒素能够在氧化环境中响应性地释放。由于正常组织和细胞的活性氧水平相对较低，该特性可以支持胶束在肿瘤的病理环境中选择性地释放药物。
2.4.3 胶束的体外靶向性评价
（1）荧光探针胶束的制备：由于鬼臼毒素不具有荧光性，因此本实验选用具有绿色荧光的香豆素作为荧光探针代替鬼臼毒素，以评价胶束的体外细胞摄取情况。各胶束制备方法同“2.1”项。
（2）荧光显微镜观察胶束摄取情况：将SK-OV-3 细胞以1.3 ×105/ 孔的密度接种于6 孔板中，孵育24 h 后将B-Ms 、香豆素游离药、Cou-Ms 、HA-Ms/ Cou 、HA-oxi-Ms/Cou 和HA-oxi-Ms/Cou ＋H2O2 加到孔中（各孔中香豆素的终浓度均为3 μmol/L 。以B-Ms 作为对照，每组3 个复孔），继续孵育1 h ，DAPI 避光染色15 min ，利用荧光显微镜观察荧光强度并拍照，结果如表4 和图8 所示，对照组细胞未见绿色荧光，给药组具有明显绿色荧光，荧光强度为B-Ms＜香豆素＜Cou-Ms＜HA-oxi-Ms/Cou＜HA-oxi-Ms/Cou＋H2O2＜HA-Ms/Cou，表明通过透明质酸修饰胶束，可显著增加SK-OV-3细胞对药物的摄取；同时，也进一步证实了HA-oxi-Ms/Cou具有活性氧响应能力，PEG5000水化层脱落后，其靶向SK-OV-3细胞的能力与HA-Ms/Cou相当。
（3）流式细胞仪考察胶束摄取情况：细胞模型的建立同“（2 ）”项方法，SK-OV-3 细胞在含药培养基中培养1 h 后，用冷PBS 洗3 次，消化后用300 μL PBS 复悬，采用流式细胞仪测定与细胞结合的香豆素的荧光强度，结果如图9 和表5 所示。流式细胞仪的测定结果与荧光显微镜观察结果相一致，进一步验证透明质酸修饰胶束，可以使药物更容易在SK-OV-3 细胞中蓄积。
2.4.4 胶束对SK-OV-3 细胞的细胞毒性采用CCK-8 法对细胞存活率进行考察。以1.5 ×104/ 孔的密度将SK-OV-3 细胞接种于96 孔板，培养24 h 后，根据预实验结果加入不同浓度的B-Ms 、鬼臼毒素、Pod-Ms 、HA-Ms/Pod 、HA-oxi-Ms/Pod 和HA-oxi-Ms/Pod ＋H2O2 ，每个浓度设置5 个复孔，以DMEM 培养基为空白对照。继续培养48 h 后弃掉培养液，向各孔中加入含10% CCK-8 的培养液，继续孵育2 h 后，于450 nm 处测量样品吸光度（A ），计算细胞存活率，各组细胞存活率测定结果见表6 。
细胞存活率＝A1/A2
A1 为给药组的吸光度数值，A2 为空白对照组的吸光度数值
实验结果显示，将鬼臼毒素制备成纳米胶束，显著提高其对肿瘤细胞的杀伤作用，其原因可能为胶束增加了鬼臼毒素的水溶性；透明质酸修饰的胶束比普通胶束具有更强的细胞毒性，其原因可能为透明质酸与肿瘤细胞表面过表达的CD44相互作用，增强了肿瘤细胞对胶束的摄取，从而增加了鬼臼毒素的功效；此外，HA-oxi-Ms/Pod＋H2O2的细胞毒性与HA-Ms/Pod相当，并无显著性差异，且效果优于其他组别，证明了HA-oxi-Ms/Pod兼具活性氧响应性及主动靶向性。
2.4.5 胶束抑制SK-OV-3 细胞迁移能力评价利用Transwell 小室法检测不同给药组对SK-OV-3 细胞迁移能力的影响。将Transwell 小室放入24 孔板中，使用无血清1640 培养基重悬SK-OV-3 细胞后，将180 μL 细胞加至上腔室中；同时，将600 μL 含血清培养基加至下腔室中；分别将B-Ms 、Pod-Ms 、HA-oxi-Ms/Pod 、HA-oxi-Ms/Pod ＋H2O2 以20 μL/ 孔加入上腔室中，孵育12 h 后将小室取出，PBS 清洗小室内部3 次，用棉签刮擦去除小室内部细胞，用4% 多聚甲醛固定通过膜迁移的细胞30 min ，然后用0.1% 结晶紫溶液室温染色20 min 。最后PBS 冲洗干净，晾干，置倒置显微镜下观察并拍照计数，以迁移过膜的细胞数平均值评估细胞迁移能力。
实验结果如图10 和表7 所示，B-Ms 、Pod-Ms 、HA-oxi-Ms/ Pod 、HA-oxi-Ms/Pod ＋H2O2 抑制SK-OV-3 细胞迁移能力逐渐增强；与HA-oxi-Ms/Pod 相比，HA-oxi-Ms/Pod ＋H2O2 抑制SK-OV-3 细胞迁移能力更强，差异存在统计意义（P ＜0.05）。
3 讨论
卵巢癌是妇科恶性肿瘤中致死率最高的一种疾病，起病隐匿，病情发展迅速，严重影响广大女性的健康。化学疗法是目前应用最广泛的治疗方法。然而，由于治疗药物的水溶性差和不良反应大等问题，化疗的疗效远未令人满意[14] 。
鬼臼毒素是一种天然芳基四萜木脂素，研究表明，鬼臼毒素对多种肿瘤细胞均具有显著的杀伤作用[2-3] 。鬼臼毒素能够特异性地与细胞分裂过程中的微管结合，抑制有丝分裂纺锤体的形成[15] 。然而，鬼臼毒素存在水溶性差及较高的非靶标毒性等问题，限制了其在临床中的广泛应用[16] 。因此，开发多策略纳米递药系统，可以减轻鬼臼毒素不良反应，增强其靶向性，提高其抗肿瘤效果。肿瘤细胞通常呈现氧化应激态，即活性氧的产生与抗氧化防御之间的失衡，倾向于氧化。在肿瘤细胞内，活性氧的浓度通常是正常细胞的100 倍[17-18] 。
活性氧响应键TK （Thioketal ）是由硫和碳元素构成的酮缩硫醇键，其能在活性氧环境下被氧化，从而断裂，因而被广泛用于设计活性氧响应性药物递送系统。在特定的病理状态（如肿瘤或炎症部位），含有TK 键的药物载体可以在这些特定部位选择性地裂解，从而实现药物的靶向释放，减少对健康组织的不良反应[17] 。这种递药系统能够提高药物的靶向性，使药物在SK-OV-3 细胞中的释放量更高，增强治疗的效果。近年来，透明质酸被广泛用于修饰靶向药物递送系统，其可以与肿瘤细胞表面糖- 蛋白中高度表达的CD44 结合，实现药物递送系统的主动靶向效果[19-21] 。
本研究通过薄膜分散法成功构建一种新型透明质酸修饰活性氧敏感鬼臼毒素纳米胶束，以BBD-RSM 确定最优处方，经验证胶束包封率为（94.28 ±0.51 ）% 。进一步对胶束理化性质进行表征，经实验测得HA-oxi-Ms/Pod 的平均粒径为（104.85 ±1.03 ）nm ，ζ 电位为（−6.40 ±0.43 ）mV ，体外释放表现为缓释性质；活性氧响应后胶束粒径缩短，药物的体外释放行为增加，表明该胶束具有活性氧响应能力；通过体外摄取实验，验证透明质酸修饰胶束在SK-OV-3 细胞中的摄取情况显著高于未修饰胶束，HA-oxi-Ms/Pod 在高浓度活性氧环境中的摄取情况与HA-Ms/Pod 相当。
此外，本研究进一步通过细胞毒性实验考察HA-oxi-Ms/Pod 对SK-OV-3 细胞存活率的影响，结果显示其半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration ，IC50 ）值为18.94 μmol/L ，活性氧敏感键断裂后IC50 值为6.975 μmol/L ，表现出更强的杀伤肿瘤细胞活性。本制剂将为后续卵巢癌等疾病的治疗与研究提供参考，为肿瘤靶向制剂的研发提供实验依据。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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