脑类器官是模拟大脑某些三维 (3D) 细胞结构和功能方面的重要模型。多电极阵列 (MEA) 能够记录和刺激来自产电细胞的活动，为研究脑类器官提供了显著的潜力。然而，传统的 MEA 最初是为单层培养而设计的，其记录接触面积有限，仅限于 3D 类器官的底部。受脑电图帽形状的启发，我们开发了用于类器官的微型晶圆集成 MEA 帽。光学透明外壳由自折叠聚合物小叶和导电聚合物涂层金属电极组成。在力学模拟的指导下，微型帽聚合物小叶的可调折叠能够实现对不同大小的类器官的多功能记录，我们验证了从 400 到 600 微米大小的类器官进行长达 4 周的电生理记录的可行性，并验证了对谷氨酸刺激的反应。我们的研究表明，3D 壳 MEA 在高信噪比和 3D 时空脑器官记录方面具有巨大潜力。

一、简介

由于对人类大脑的直接研究在实践和伦理上受到限制，并且动物模型存在物种间差异的局限性，使用人类细胞的体外模型已成为了解神经回路、神经毒性、神经系统疾病和大脑发育的一种有吸引力的替代方法。值得注意的是，近年来，人类体外模型领域取得了显著进展。特别是，多能干细胞衍生的脑类器官具有三维（3D）多细胞结构和发育特征，已被证明可以复制人类大脑的关键特征。在开发脑类器官的同时，需要开发电子和光学基础设施，用于原位刺激和记录电活动，以评估其功能和生理相关性。

多电极阵列（MEA）提供细胞外电场电位的非侵入式高速记录和网络映射。然而，传统的体外 MEA 板主要使用平面电极界面，最初设计用于单层培养，因此限制了与 3D 类器官的接触表面积。这些 MEA 板上已进行了多种修改，例如脊柱状电极、纳米线和 3D 纳米结构，以增加信号。例如，脊柱状金电极已用于减少细胞外间隙以获得更好的信噪比 (SNR)，而垂直纳米线则可通过穿透提供对被测细胞内部的记录访问。然而，即使在这样的装置中，记录接触面积仍然仅限于类器官与板连接的底部。最近，已引入了几种弯曲和折叠形状用于 MEA 记录，包括扣环、圆柱形和壳形。例如，我们之前曾使用 SiO/SiO2双层膜创建一个自折叠外壳，用于单个/少量心脏细胞的封装和测量，但这种单细胞装置的尺寸小且材料成分坚硬，可能不可扩展，也不适合较大的脑器官。研究人员开发了一种用于心脏和皮质类器官的圆柱形传感器阵列。该方法需要用微操作器手动展开圆柱体以包裹类器官，这会限制吞吐量并且圆柱形状也有限。研究人员展示了一种用于记录脑器官的扣状中尺度球体神经接口。这种方法需要预应变的弹性基板，这会限制与其他硅模块或微流体装置的集成。

这里我们报告了一种用于脑类器官的硅晶片集成自折叠聚合物壳 MEA 平台。我们开发了一种晶片级微加工工艺，使用自折叠聚合物双层来创建壳 MEA。制造过程简单明了，使其可能与 MEA 板兼容、可调、可扩展且经济高效。基本元素是自折叠负性光刻胶聚合物 (SU8) 双层，可根据相对厚度和曝光能量调整折叠。金线和接触垫集成在自折叠双层内，以便与暴露的导电聚合物聚-(3,4-乙烯二氧噻吩)：聚(苯乙烯磺酸盐) (PEDOT:PSS) 涂层电极实现良好的绝缘。自折叠的程度由有限元法 (FEM) 模型指导，其中为通过不同曝光能量交联的 SU8 开发了本构关系和丙酮处理后的体积收缩。我们展示了可以为不同大小的类器官创建可定制的外壳，从而在电极和脑类器官之间建立松散或牢固的接触。材料和自折叠过程具有生物相容性，并且外壳电极的透明小叶允许原位明场和荧光成像。我们展示了在有和没有谷氨酸刺激的情况下对封装在 3D 外壳电极中的脑类器官进行 3D 时空记录。我们通过比较对谷氨酸的累积放电和电反应来对比 2D 和 3D 记录。放电通过一个简单的阈值来定义，并使用 Wilcoxon 秩和（置换）检验对尖峰分布进行非参数比较。使用非参数 Mann-Kendall 趋势检验总结了对谷氨酸干预的反应，并再次通过置换 MEA 类型（2D 和 3D）标签进行推断。使用 3D MEA 检测到了放电分布的转变，放电率更高，估计的谷氨酸介导趋势更强。总之，我们的平台和研究展示了一种用于映射脑器官中电活动的独特 3D 方法，与传统 MEA 相比，它提供了更大的记录接触面积。

二、结果

2.1 外壳 MEA 的概念和制造

我们开发 3D 外壳电极的灵感来自用于研究人脑电活动的宏观脑电图 (EEG) 帽 。这些帽通常由柔性材料组成，多个金属电极覆盖整个头皮，允许从其整个 3D 形状采集电信号。同样，我们将外壳 MEA 设计为由可以包裹脑器官表面的小叶组成。作为概念验证，我们在 3D 表面上分布了三个带有三个电极的小叶。我们的制造方法与包含多个电极阵列和以不同角度折叠的小叶的替代设计兼容。简而言之，我们的制备工艺包括以下步骤：(i) 牺牲层沉积，(ii) 第一层 SU8 图案化，(iii) 金线图案化，(iv) 第二层 SU8 图案化，(v) PEDOT:PSS 电极图案化，(vi) 牺牲层溶解和预处理，(vii) 灭菌并置于细胞培养基中，以及 (viii) 类器官放置和自折叠，如图 1A 所示。我们目前的工艺使用了五个光掩模，我们通常在 3 英寸硅（不透明，SiO2 涂层）或石英（透明）晶片上制备八个壳，每个壳有三个电极（图 1B）。我们选择 SU8 作为壳 MEA，因为它是一种流行的负性光刻胶，并且已经广泛应用于微流体和微机电系统工艺。我们之前曾报道过制造工艺，并展示了具有溶剂交换的 3D SU8 结构的自折叠机制（图 1，C 和 D）。由于其在微系统制造中的广泛应用，因此关于其加工、生物相容性以及与其他模块集成的简易性方面拥有丰富的技术知识，这些模块可能在未来集成用于类器官的化学或光学检测。我们选择金作为布线材料，因为它具有高电导率和良好的生物相容性。我们在电极上添加了导电聚合物 PEDOT:PSS 涂层，以降低阻抗并最大限度地减少MEA/类器官接触的模量失配（图 1E 和图 S1）。将参考电极放置在壳电极附近以进行数据采集（图 S2）。我们的制造和折叠工艺与 AutoCAD 掩模设计和多层光刻兼容，因此可扩展。

图 1. 3D 壳 MEA 的制造工艺流程和实验图像。（A）3D 壳 MEA 的制造工艺流程。（B）制造的壳 MEA 的光学图像。（C）扁平状态下壳电极的放大光学图像。比例尺，200 μm。（D）启动后壳 MEA 的扫描电子显微镜 (SEM) 图像。比例尺，100 μm。（E）导电聚合物 PEDOT:PSS 电镀之前（左）和之后（右）小叶上的记录电极。比例尺，50 μm。

2.2 脑类器官特征

我们从人类诱导多能干细胞 (iPSC、NIBSC8 系) 生成了本研究中使用的脑类器官。我们分化神经祖细胞 (NPC)（时间零点），然后将 NPC 细胞悬浮液置于持续旋转摇动下形成 3D 脑类器官，持续摇动时间长达 8 至 10 周，如前所述。成熟的脑类器官是均质的，大小从 400 到 600 μm 不等，由神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞组成（图 2）。

图 2. 脑类器官模型。（A）八周脑类器官用神经元标记物 MAP2（绿色）和神经祖细胞标记物 Nestin（红色）染色。（B）八周脑类器官用神经元标记物 β-III-微管蛋白（绿色）和星形胶质细胞标记物 GFAP（红色）染色。细胞核用 Hoechst（蓝色）染色。比例尺，100 μm。（C）RT-PCR 显示分化 10 周内神经祖细胞 (Nestin)、神经元 (NeuN)、星形胶质细胞 (GFAP) 和少突胶质细胞 (MBP) 基因的表达。数据以平均值 ± SEM 表示，n = 3。MAP2，微管相关蛋白 2；GFAP，神经胶质纤维酸性蛋白；MBP，髓鞘碱性蛋白；NeuN，神经元细胞核；NPC，神经祖细胞；2w、4w、8w、10w分别表示从NPC阶段开始分化2、4、8、10周。

在图 2（A 和 B）中，我们展示了一个 8 周的脑类器官，该类器官被神经元标记物微管相关蛋白 2 (MAP2) 和 β-III-微管蛋白（绿色）、神经祖细胞标记物 Nestin（红色）和星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)（红色）染色。图 2C 显示了神经分化标记物随时间的基因表达，涵盖了 NPC 到分化 10 周的阶段。随着时间的推移，成熟神经元 [神经元核 (NeuN)]、星形胶质细胞 (GFAP) 和少突胶质细胞 [髓鞘碱性蛋白 (MBP)] 标记物增加，神经祖细胞标记物 (Nestin) 减少。成熟神经元、星形胶质细胞和成熟少突胶质细胞的存在是脑类器官功能的关键，该功能通过系统的电活动来衡量。神经元成熟可增加突触形成，而星形胶质细胞则支持这一过程。少突胶质细胞在轴突周围提供髓鞘，从而减少离子泄漏和细胞膜电容，从而实现高效的电信号传输。我们之前证明，按照我们的方案，我们可以获得高达 40% 的髓鞘轴突，众所周知，用人脑细胞在体外建模髓鞘轴突具有挑战性。

2.3 折叠角度、形状和电极图案的可调性

我们结合数值模拟和实验试验，开发出一种合理可靠的自折叠设计，以实现可重复组装并确保类器官和外壳 MEA 电极之间的良好接触。最佳的外壳 MEA 装置应像帽子一样适合目标脑类器官的外轮廓（图 S3）。控制折叠角度的关键参数包括 SU8 双层厚度和紫外线 (UV) 曝光。

我们开发了一个 FEM 模型，并使用它来模拟聚合物外壳与电极一起的自折叠行为（详情见注释 S1 和 S2）。该模型使我们能够独立调整设计参数，包括整体尺寸和几何形状、双层/电极厚度以及顶层和底层的紫外线曝光，并在模拟中预测折叠后的完全平衡结构。对于图 1C 中所示的典型壳 MEA，我们进行了模拟以比较实验结果，并研究 SU8 双层厚度和两层之间的曝光能量差异对最终折叠壳形状的影响（图 3A）。总体而言，模拟结果清楚地表明，随着厚度的减小，折叠度增加（即曲率半径减小）。随着我们扩大 SU8 双层的厚度，由于弯曲刚度更高，折叠度减少，这超过了两层失配应变引起的反作用。此外，SU8 双层之间的曝光能量差异也在壳电极最终所需的 3D 形状中发挥了重要作用。随着顶层曝光能量的增加，整体折叠度减少。SU8 双层之间的曝光能量差异在整个双层中产生整体聚合梯度。聚合梯度导致沿双层厚度的失配应变，并为 SU8 双层自发折叠提供弯矩。我们可以通过 FEM 合理预测折叠，原则上，利用我们的光刻集成工艺，从 100 到 10 厘米的尺度生成 3D 壳结构。这种大范围的尺寸可调性有利于记录不同尺寸的类器官的活动。

图 3. 3D MEA 可编程折叠的 FEM 模拟和脑类器官封装的光学图像。（A）描绘模拟曲率半径 (ROC) 与 SU8 双层厚度和顶层曝光能量的关系的图。左上角的图像显示了平坦状态下的外壳尺寸。从左到右的尖端到尖端距离为 1450 μm。（B）FEM 快照显示不同尺寸（400 至 600 μm）的类器官适合定制的外壳电极。（C）具有不同折叠程度的 3D 外壳电极的相应 SEM 图像。图像是假彩色的，蓝色表示 SU8 外壳，黄色表示电极。比例尺，100 μm。(D) 3D 外壳 MEA 中的类器官的明场图像，以及 (E) 共聚焦图像显示脑类器官（绿色，Fluo-4 钙染料）的顶视图（投影共聚焦堆栈），该类器官直径约为 500 μm，封装在 3D 外壳（蓝色）电极中。比例尺，100 μm。

我们将 FEM 结果与实验测量结果进行了比较，使用三种不同厚度和顶层紫外线照射的 SU8 双层条件（从上到下：4.6 μm，180 mJ/cm2 紫外线照射；6.0 μm，180 mJ/cm2 紫外线照射；和 8.0 μm，120 mJ/cm2 紫外线照射），底层完全交联（240 mJ/cm2 紫外线照射）。这些不同的条件产生的双层折叠程度不同，与模拟结果一致（图 3C）。接下来，我们研究了壳电极如何捕获不同大小的脑类器官。一般来说，这里使用的脑类器官的直径在 400 到 600 μm 之间。因此，我们模拟了不同的壳电极如何分别封装直径为 400、500 和 600 μm 的脑类器官（图 3B）。这些模拟结果与我们的实验观察结果相符，其中脑类器官被很好地封装在 3D 折叠壳电极中（图 3D）。图 3E显示了包裹在 3D 折叠壳电极内的脑类器官的共聚焦显微镜钙图像。3D 壳电极装置的透明 SU8 叶片为未来的光学刺激提供了潜力。3D 壳电极折叠过程的时间尺度（通常在一小时内完成）包括足够的时间对脑类器官进行灭菌和封装（图 S4）。壳电极的折叠可以通过溶剂交换逆向进行，这显示出可重复使用电极的潜力（图 S5）。对封装的脑类器官进行了细胞毒性测试，并与自由漂浮的类器官的结果进行了比较（图 S6），以验证该过程的生物相容性。

2.4 自发活动和谷氨酸诱导电活动记录的可行性

我们证明了通过每个小叶上的电极记录脑类器官的 3D 空间电生理活动的可行性。在自折叠过程中，将一个 9 周的脑类器官放置在壳电极的中心，这使得类器官被包裹在小叶内，PEDOT:PSS 电极与类器官紧密接触（图 4B）。在设备周围放置一个玻璃圆筒以容纳细胞培养基。制作了电极输出以进行信号采集（图 4A）。小叶上的三个 PEDOT:PSS 电极成功记录了包裹的脑类器官的场电位（图 4C 和图 S7）。光栅图（图 4D）显示了包裹的脑类器官的自发活动的记录。叠加的尖峰波形表示平均尖峰持续时间约为 2 毫秒，记录过程中幅度各不相同（图 4E）。我们注意到，我们可以在小叶上添加更多的电极来改善记录（图 S8 和 S15）。

图 4. 封装脑类器官的 3D 外壳 MEA 记录。（A）石英晶片集成 3D 外壳 MEA 的图像。（B）3D 外壳 MEA 在脑类器官周围的电极分布。（C）封装在 3D 外壳 MEA 内的脑类器官记录的典型场电位。CH，通道。（D）脑类器官自发放电的代表性光栅图。（E）来自通道 1 的代表性叠加尖峰波形。（F）谷氨酸治疗前后记录的脑类器官的尖峰分布比较。

我们通过检查对培养基中添加的 20 μM 谷氨酸神经递质的反应（作为自发记录的阳性对照）进一步确认记录的信号来自脑类器官。谷氨酸应用之前和之后的尖峰 SNR 在发射尖峰的幅度上显示出统计学上显着的放大（中位数增加了 57.6%）（图 4F）。详细的聚类还表明，在谷氨酸诱导的信号中观察到更长的尖峰间隔（图 S9）。

2.5 不同电极配置的设计

为了深入了解 3D 与 2D 记录以及近端与远端电极的相对优点，我们设计了一个阵列，除了 3D 外壳 MEA 电极外，该阵列的底部表面还有四个电极。这种配置还证明了我们的制造方法可以轻松针对不同的电极组合进行调整。

虽然传统的 MEA 记录方法已经很成熟，但 3D 多电极设备的记录仍处于非常早期的阶段。在之前的研究中，研究人员将 3D 记录与传统的 2D 记录进行了比较，但这些通常是不同的类器官。我们还使用 2D MEA 系统和以展开格式的外壳 MEA (图 S11) 进行了脑类器官记录。两者均显示出相似的尖峰持续时间，约为 2 毫秒。这些研究表明我们的记录平台可以进行 2D 记录，并使我们能够将这些 2D 记录与 3D 记录进行比较。

值得注意的是，3D MEA 提供了更多的记录电极垫，接触面积更大，并分布在类器官周围。为了直接观察这些特征的影响，我们设计了 3D 壳电极，其中有三个电极，每个小叶上一个，壳的底部中心还有一个额外的第四个电极（图 S12A）。一旦壳电极折叠起来，类器官被封装起来（图 S12B），我们不仅可以从 3D 折叠壳电极记录，还可以从底部电极记录。我们观察到，三个折叠电极的累积尖峰计数明显大于单独底部电极的累积尖峰计数（图 S12C）。虽然从数学上讲，尖峰事件的并集大于单个电极的事件是必要的，但图 S12 展示了差异的范围。我们还观察到不同电极之间的信号异质性，表明这种 MEA 可以探测时空电活动（图 S12D）。类器官 1 是最极端的，因为大多数尖峰发生在远离底部电极的地方。堆积条形图（图 S12C）显示，电极 1、2 和 3 带来独立信息，如果仅考虑底部电极，则这些信息会丢失。

利用我们的壳电极方法，我们可以将远端电极折叠成具有 3D 空间分布的近端电极。由于不同脑器官中的样本存在差异，系统地研究 2D（折叠前）电极和 3D（折叠）壳电极在脑器官中的记录之间的差异具有挑战性，而且在已发表的文献中也缺乏这方面研究。因此，我们设计了一个电极系统并进行了实验，其中 2D 电极（图 5A 中的编号 4、5、6 和 7）和 3D 壳电极（图 5A 中的编号 1、2 和 3）能够同时记录来自同一个脑器官的信号。这也使我们能够研究电极和脑器官之间距离的影响。在折叠过程之前，所有电极都与平壳的中心等距（图 5A）。一旦 MEA 外壳折叠，小叶就会包裹住脑类器官，这样特定电极就会靠近脑类器官（图 5B），而其他电极则不会。对于传统的 MEA 来说，实现这种定位可能很困难，因为在 2D MEA 上接种的脑类器官的位置无法得到很好的控制，因为它们没有被包裹，而且唯一的近端电极位置是球形类器官的正底部。

图 5. 不同电极配置的研究。（A）3D 壳电极和 2D 电极在平坦（左）和自折叠（右）状态下的光学图像。比例尺，200 μm。（B）包裹脑类器官的 3D 壳电极（编号 1、2 和 3）以及 2D 电极（编号 4、5、6 和 7）的光学图像。比例尺，200 μm。（C）3D 壳和 2D 记录的光栅图。（D）具有不同信噪比 (SNR) 的尖峰计数直方图，比较 3D 和 2D 通道。该图显示 3D 通道具有更大的捕获具有不同 SNR 的信号的能力。（E）3D 和 2D 电极记录的成对尖峰的 SNR。（F）谷氨酸刺激下的二维和三维通道的趋势统计。

我们注意到，在 2D MEA 记录中，需要使用细胞粘附蛋白或Matrigel 涂层来增强附着力并促进神经突从类器官生长到电极，而外壳 MEA 中则不需要涂层。3D 外壳 MEA 将类器官固定在其抓握范围内，并在电极靠近类器官的运动过程中使其保持相对稳定（与 2D MEA 相比）。此外，3D MEA 中没有表面涂层可防止单个细胞从类器官中迁移和神经突生长，这在 2D MEA 中是不可避免的，其中涂层对于保持类器官附着在电极上至关重要。因此，在 2D MEA 中，即使是远距离电极也会接触到未知数量的细胞和神经突，从而导致记录的差异性更高。在我们的实验中（图 5A），2D 距离电极未与细胞或神经突接触。我们记录了四个 2D 电极和三个 3D 电极的场电位，如栅格图所示（图 5C 和图 S13）。通过对三个不同的脑器官进行五轮自发记录，我们检测到 3D 壳电极的 7785 个尖峰和 2D 平面电极的 2025 个尖峰。结果表明，当 3D 壳电极折叠起来到达 3D 脑器官表面时，它们可以检测到比远离脑器官的电极更多的尖峰（图 5D）。此外，为了对记录质量进行直接和公平的比较，我们分析了 3D 壳电极和 2D 平面电极检测到的 1860 个尖峰。3D 壳电极通道中相同尖峰的 SNR 明显高于 2D 通道（中位数增加 42%，P < 0.005）（图 5E）。我们还比较了 3D 和 2D 记录对谷氨酸刺激的敏感性（图 S14）。我们用 20 μM 谷氨酸刺激脑类器官五轮，3D 壳电极检测到电生理活动明显增加（通过 Mann-Kendall 的尖峰幅度 z 量化，P = 0.02；图 5F）。总之，对于脑类器官，3D 壳电极的记录检测到更多尖峰，对刺激引起的活动更敏感，因此与原始 2D 电极相比，电生理记录增强，未来具有空间分析的潜力。

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三、结论

总之，我们报道了一种用于脑类器官的晶圆集成自折叠 3D 外壳 MEA 神经接口。我们为不同大小的类器官创建了合理的设计和可定制的适配，这对于在成熟和发育的不同阶段记录类器官非常重要。与明显更坚硬的硅或金属材料相比，聚合物（SU8 和导电 PEDOT:PSS 涂层）的加入最大限度地减少了记录设备和类器官之间的模量不匹配。我们的差异交联双层自折叠方法还可以用于未来迭代中更柔软的聚合物和水凝胶。我们的自折叠过程高度并行，与传统光刻兼容，并且不需要任何探针或转移步骤。因此，它可以在晶圆规模上实现，以便与替代微电子、微流体和微机械组件轻松微集成。我们还可以使用传统的光刻工艺轻松改变记录电极和导线的间距和布局，这对于增加输入/输出 (I/O) 是必要的。除了记录之外，MEA 还可用于刺激。此外，我们的集成方法适用于互补金属氧化物半导体 (CMOS) 或相关组件的集成。我们已经证明了我们的 3D 壳电极具有强大的 3D 记录能力，并评估了它们相对于 2D 电极和存在刺激物时的性能。

未来，我们将寻求解决本研究的一些局限性。例如，在当前研究中，我们需要手动将类器官插入壳电极。此外，通过集成微孔或微流体接口，我们预计可以在壳电极内培养类器官，从而形成高通量的电极集成类器官阵列。在目前设计的基础上，我们还可以通过使用其他互连布局和更高分辨率的光刻技术来增加 I/O 数量或使用 CMOS 传感器以获得更高的记录分辨率，并创建多孔小叶以增强氧气和营养物质的运输，以及稳定的长期记录和刺激。此外，可以设想使用具有表面图案或突起的可折叠电极，以便它们穿透并促进从类器官内部进行记录，这些策略与我们的微加工和自折叠方法兼容。

这项研究为更深入地分析脑器官的神经细胞连接组和脑器官与机器接口开辟了道路。基于人工智能的人类脑电图分析方法可用于分析此类记录。最终，这种分析可能使脑器官中原始认知功能的实现成为可能。

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