以大肠杆菌为代表的原核表达系统是最早且最经济的蛋白质生产方式。尽管随着基因工程技术的发展，表达系统已经扩展到真核系统如酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动物细胞，但 大肠杆菌表达系统依然因其独特的优势而保持着广泛的应用，在分子生物学和生物技术研究中依旧占据着举足轻重的地位。
图1：大肠杆菌重组蛋白表达系统的应用
大肠杆菌表达体系具有表达量高、周期短、成本低等诸多优势。据统计， 超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。下面主要介绍一下大肠杆菌的生产过程、优缺点以及发酵的影响因素。
一、大肠杆菌的生产过程
1、菌种准备与保藏
首先，从基因库或实验室保存的菌种中，筛选出符合生产需求的大肠杆菌菌株，并通过PCR、测序等方法进行鉴定，确保其遗传特性稳定。其次，将冷冻保存的菌种在适宜条件下复苏，通过划线分离或液体培养等方法进行纯化，以获得单一菌落。最后，将纯化后的菌种在低温条件下进行长期保藏，以备后续使用。
2、种子培养
根据大肠杆菌的生长需求，配制含有碳源、氮源、无机盐等营养成分的种子培养基。将复苏后的菌种接种到装有种子培养基的摇瓶中，在适宜的温度、转速和通气条件下，使用生物培养振荡器进行培养，使菌体数量迅速增加。通过测定OD值、活菌数等指标，监控种子液的质量，确保种子液中菌体数量充足且活性良好。
为了解决生物培养过程中摇床常见的培养结果不稳定、摇床连续运转高故障率的问题， 西尔曼科技近日推出了其最新研发的生物培养振荡器EM-10。该生物培养振荡器采用了自主研发的ARM控制平台，能够提供精确将温场控制在±0.5℃（at37℃、100rpm），具有媲美航空保温性能，确保实验样本在最佳环境下生长与反应。
3、发酵生产
清洗并消毒发酵罐，确保其无菌状态。然后加入预配好的发酵培养基，并调节至适宜的pH值和温度。将种子液以适当的比例接种到发酵罐中，开始发酵过程。在发酵过程中，通过控制温度、pH值、搅拌速度、通气量等参数，优化菌体的生长和代谢环境。同时，实时监控发酵过程中的关键参数并及时调整。当发酵达到预定时间或产物浓度达到要求时，停止发酵。通过离心、过滤等方法将菌体和发酵液分离，收集含有目标产物的发酵液。
4、产物纯化与后处理
根据产物的性质选择合适的提取方法，如溶剂萃取、离子交换、亲和层析等，从发酵液中提取目标产物。通过多步纯化步骤，如透析、超滤、凝胶过滤层析等，去除杂质和副产物，提高产物的纯度和质量。利用高效液相色谱、质谱、电泳等方法对纯化后的产物进行检测和分析，确保其符合质量标准。
二、大肠杆菌表达系统的优缺点
1、主要优点
①遗传学背景清晰。大肠杆菌的遗传背景和生理特点已研究得非常清楚，有很多有不同抗药性、不同营养缺陷型、不同校正突变型的菌株可供选用。
②表达量高。大肠杆菌的表达水平通常高于真核表达系统，并且表达易于调控。
③生长快速。大肠杆菌是一种生长速度极快的细菌，通常在指数生长期每20-30分钟分裂一次。其在适宜的条件下，如使用LB培养基，在37℃下培养，其细胞数量可以在短时间内快速增加，一般几个小时就能达到较高的密度，这有利于快速获得大量的表达蛋白。
④易培养且成本低。大肠杆菌对培养环境和营养条件的要求不高，培养成本低廉，适用于大规模生产。
⑤抗污染能力强。大肠杆菌对许多抗生素具有抗性，能够在实验室条件下稳定生存。
2、主要缺点
①无法翻译后修饰。大肠杆菌不能对蛋白质进行像真核生物那样的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等，这会影响蛋白质的活性和功能。
②易形成包涵体。许多外源蛋白在大肠杆菌中表达后，会形成不溶性的包涵体，这不仅会降低蛋白的表达量，还需要额外的步骤进行包涵体的变性和复性，增加了实验的复杂性和难度。
③分泌机制有限。大肠杆菌缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成二硫键的能力。
④内毒素问题。大肠杆菌本身会产生结构复杂、种类繁多的内毒素，在分离纯化时不易除尽。
三、影响大肠杆菌发酵的因素
在大肠杆菌发酵中，为了获得更高的表达量，除了挑选合适的菌种，对发酵过程实行精确的调控也是十分重要的。如确保充足的溶氧量和严格的pH值控制、选择适宜的发酵温度和诱导时间以及优化碳氮比，以及合理调节补料速率与比生长速率，均可以显著提高发酵效率和产物质量。
1、溶氧量
发酵过程中大肠杆菌的生长和代谢都需要氧气，所以通过溶氧可以较为直观地判断发酵过程中菌体的情况。若是溶氧不足，会影响菌体的代谢活动，从而导致产物合成受阻。
2、pH值
严格的pH值控制是大肠杆菌发酵成功的关键之一。pH值过高或过低都会直接影响菌体的生长和代谢产物的积累。另外，补酸碱时，速率应保持平缓，避免剧烈变化对菌体造成应激。
3、温度
温度对微生物的生长和产物的合成代谢过程中起到催化作用的各种酶的活性能起到较为直观的影响，因此在发酵过程中的环境温度需要保持在一个稳定而合适的状态。另外，通过调控温度也可以起到诱导微生物发酵结果的作用，以大肠杆菌为例：其最适生长温度是37℃，发酵过程中可以先将温度调至30℃降低其生长速率减少对底物的消耗，在其进入表达期后再升高温度促进其代谢从而获得更少的菌体和更高的表达量，降低下游纯化的压力。
4、诱导时间
选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内。选在这一阶段诱导，一是将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；二是由于此时已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，所以不论是从动力学角度还是能耗、物料成本方面，都比较合理。
5、碳氮比
补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累；若氮源不足，则菌体繁殖量少，影响产量。若碳源过多，则容易导致pH值过低，抑制菌体生长；反之则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
6、补料速率与比生长速率
补料速率是指向发酵液中添加营养物质的速度，比生长速率是菌体生长速度与补料速率的比值。补料速率与比生长速率直接影响乙酸的生成速率和积累量。通过合理控制这两个参数，可以有效调节发酵液中的残糖量，从而实现对乙酸产量的精准控制。适当的补料速率和比生长速率不仅能优化菌体的生长状态，还能提高目标产物的产量和质量。
参考资料：
[1]蛋白纯化丨四大蛋白表达系统全解析.舒桐科技.2024年05月21日.
[3]文章推荐 | 重组蛋白质在大肠杆菌体系中的可溶性表达策略.中国生物工程杂志.2023年12月07日.
[4]生物工厂的未来：大肠杆菌发酵技术在现代工业中的发展.北京安必奇生物科技有限公司. 2024年07月02日.
[5]大肠杆菌发酵生产工艺流程详解.发酵技术圈.2024年09月12日.
[6]原核表达小贴士：宿主菌，你选对了吗？.Chaselection逐典.2024年09月12日.
[7]唐炳华，郑晓珂.分子生物学[M].北京：中国中医药出版社，2017.
[8]罗贵民. 酶工程（第三版）[M]. 化学工业出版社.2016.
[9]大肠杆菌发酵过程中的关键控制因素.诺福生态杀菌专家.2024年10月12日.
[10]大肠杆菌发酵过程中的重要影响因素.发酵技术圈.2024年04月26日.
[11]大肠杆菌高密度发酵影响因素解析.生物制药合伙人.2021年12月01日.返回搜狐，查看更多
责任编辑：