在生命科学领域的科研工作中，准确测定人 5 羟色胺（5 - HT）的含量对于深入了解神经生理、精神健康等诸多方面具有重要意义。人 5 羟色胺（5 - HT）定量检测试剂盒（ELISA）专门为科研设计，能对血清、血浆、细胞培养上清液以及组织中的人 5 羟色胺含量进行精准定量检测。使用该试剂盒前，科研人员务必仔细研读说明书，严格按照要求操作，因为它仅供科研使用，严禁用于临床诊断。

一、实验原理

该试剂盒运用酶联免疫分析方法，以生物素标记 5 - HT，用纯化的抗 5 - HT 抗体包被微孔板。在竞争抑制反应中，一定量的固相抗体与生物素标记 5 - HT 及非标记抗原（校准品或标本）展开抑制竞争。非标记抗原的量决定了抗体与生物素标记的 5 - HT 的结合量，非标记抗原量越多，抗体与生物素标记的 5 - HT 结合就越少，反之则越多。反应平衡后，形成固相抗体 - 生物素化 5 - HT，接着加入酶标记的亲和素，形成固相抗体 - 生物素化 5 - HT - 酶标 - 亲合素复合物。加入底物显色后，通过酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值）。随着 5 - HT 浓度升高，OD 值逐渐下降，呈现良好的线性关系。此试剂盒灵敏度高、特异性强、重复性好，操作简便且快速，能可靠地检测出血清中 5 - HT 的变化情况。

二、试剂盒限制性

1. 明确仅供科研使用，绝不能用于临床诊断，这是保障实验数据用途合法性和科学性的关键。
2. 必须在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品可能因试剂性能改变而导致实验结果不准确，因此过期后切勿使用。
3. 禁止与其他厂家的试剂盒或组分混用，以免发生化学反应或相互干扰，影响最终检测结果的准确性。
4. 若样品需要稀释，可采用 PBS（PH7.4）进行稀释，以维持样品的稳定性和适宜的反应环境。
5. 若样本值高于最高标准品浓度值，需对样本进行适当稀释后再重新测定，确保检测结果处于准确可靠的范围。
6. 待测样本中可能存在的异嗜抗体会干扰检测结果，检测前务必排除这一因素，确保实验数据的可靠性。
7. 通过其他方法获得的检测结果与本试剂盒的测定结果不具有直接可比性，因为不同检测方法在原理、灵敏度等方面存在差异。

三、技术提示

1. 混合蛋白溶液时要避免起泡，因为气泡可能破坏溶液的均匀性，影响反应的准确性和实验结果。
2. 加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分采用悬臂加样，防止交叉污染，保证实验数据的真实性和可靠性。
3. 合适的温育时间和充分的洗涤步骤是保证实验结果准确的必要条件。温育时间不足或洗涤不充分都可能导致实验误差，影响最终数据的准确性。
4. 使用自动洗板机时，加入一个 30 秒浸泡的步骤，有助于提高检测精度，更有效地去除杂质，使实验结果更可靠。
5. 底物溶液正常为无色液体，若在保存过程中变为蓝色，表明底物溶液已失效，不可再使用，以免影响实验结果的准确性。
6. 终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物会瞬间变为黄色。这一操作顺序至关重要，需严格遵循。
7. 实验中用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封并在低温干燥环境下保存，以维持板条的性能稳定，方便后续实验使用。
8. 所有液体组分使用前需充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作，确保实验操作的规范性和准确性，从而获得可靠的实验结果。

四、试剂盒组分与保存

未开封的试剂盒需保存在 2 - 8 度的环境中，过期试剂盒禁止使用。试剂盒包含多种关键组分：

• 校准品：0.5ml / 管 * 6 管，由抗原配制的 6 个浓度标准品，浓度依次为 2400、1200、600、300、150、0 pg/mL，为绘制标准曲线提供准确的浓度参考，是计算样品浓度的重要依据。
• 包被微孔板：有 96T/48T 两种规格，预包被固相抗体，为抗原 - 抗体反应提供稳定的平台。
• HRP 标记抗体：6mL，HRP 标记的检测抗体，在检测过程中发挥关键作用，参与复合物的形成。
• 生物素化抗原：6mL，作为检测抗原，与样本中的 5 - HT 进行竞争反应，是检测原理的重要组成部分。
• 样本稀释液：6mL，用于稀释样本，使样本浓度符合检测要求，确保实验的准确性。
• 底物液 A：6mL，过氧化脲工作液，与底物液 B 协同作用，参与显色反应，使实验结果得以可视化。
• 底物液 B：6mL，TMB 工作液，在 HRP 的催化下发生颜色变化，直观反映 5 - HT 的含量。
• 终止液：6mL，2mol/L 稀释液，用于终止显色反应，使实验结果稳定可测，便于准确读取吸光度。
• 20× 浓缩洗涤液：30mL，含 0.15% Tween20 的 PBS，稀释后用于洗板，有效去除未结合的物质，提高实验的准确性。
• 说明书：1 份，详细介绍试剂盒的使用方法、注意事项等重要信息，是实验人员操作的重要指南。
• 自封袋：1 个，用于保存未用完的板条，保持板条的性能稳定。
• 不干胶：2 片，具体用途可能与实验标记或保存等相关。

此外，本品必须按照具有潜在感染性的物品进行处理，处理过程应遵循通用的安全措施，保障实验人员的安全和实验环境的卫生。

五、其他用品

进行实验还需准备以下器材：

• 酶标仪（450nm）：用于精确测量吸光度，是获取实验数据的核心设备，其测量准确性直接影响实验结果。
• 精密移液器及一次性吸头：确保加样的准确性和精确性，避免交叉污染，保证实验操作的可靠性。
• 蒸馏水：用于稀释试剂，保证实验溶液的浓度准确，是实验中不可或缺的溶剂。
• 洗瓶或者自动洗板机：用于洗板操作，有效去除未结合的物质，提高实验的准确性和可靠性。
• 37℃水浴锅或恒温箱：为实验提供适宜的温育环境，促进反应的顺利进行，保证实验条件的一致性。
• 500ml 量筒：用于量取一定体积的液体，辅助试剂的配制，确保试剂用量的准确性。

六、生物安全

1. 检测过程必须严格符合实验室管理规范的规定，杜绝交叉污染。所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置，保障实验室的生物安全和环境安全。
2. 试剂盒的液体组分中含有 proclin - 300 防腐剂，可能引起皮肤过敏反应。实验过程中应避免吸入烟雾与皮肤接触，如不慎接触，需及时采取相应措施。
3. 底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，实验时要避免吸入烟雾，操作过程中应做好防护措施，确保实验人员的身体健康。
4. 实验过程中应佩戴防护手套，实验完成后彻底洗手，防止有害物质对人体造成伤害，养成良好的实验安全习惯。

七、样品的采集和储存

（一）样本类型和采集

1. 细胞培养上清：在 4000rpm 条件下离心 20min，去除细胞颗粒和聚合物，将上清液保存在 20℃以下，避免反复冻融，以维持样本的稳定性和活性。
2. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，在 4000rpm 条件下离心 20min，小心地分离出血清，将其保存在 - 20℃以下，防止样本变质和 5 - HT 含量的变化。
3. 血浆：采用肝素、EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，在 4000rpm 条件下离心 20 分钟取上清，血浆同样保存在 - 20℃以下，避免反复冻融，确保样本的质量和检测结果的准确性。
4. 组织：用预冷的 PBS (0.01 M，pH = 7.4) 冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。按照 1 : 9 的重量体积比（可根据实验需要调整），将剪碎的组织与含蛋白酶抑制剂的 PBS 加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为进一步裂解组织细胞，可对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液 5000×g 离心 5 - 10 分钟，取上清检测。

（二）样本保存和稳定性

样本在 2 - 8℃条件下，可以储存 72h，或者在 - 20℃储存 6 个月。若样本收集后不是一次检测完，应按一次用量分装冻存，避免反复冻融。使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻，以保证检测结果的准确性和可靠性。

八、检验方法操作程序

1. 将各种试剂移至室温平衡两小时，使试剂达到最佳反应状态。取浓缩洗涤液，根据当批检测数量，用蒸馏水 1：20 稀释，混匀后备用。
2. 从密封袋中取出预包被板，设一个空白对照孔，不加任何液体；每个校准品设 2 孔，每孔加入对应校准品 50μl；其余每个检测孔直接加待测血清或质控品 50μl。
3. 除空白孔外，所有孔加入生物素化抗原 50μl，混匀后贴上封板膜，置于 37℃温育 60 分钟，促进抗原 - 抗体反应充分进行，确保实验结果的准确性。
4. 手工洗板时，弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置 10 秒甩干，重复 3 次后拍干；若使用洗板机，则选择洗涤 3 次程序洗板后拍干，有效去除未结合的物质，提高实验的准确性。
5. 每孔加入酶标亲合素 50μl（空白对照孔除外），混匀后贴上封板膜，再次置 37℃温育 30 分钟，形成稳定的复合物，为后续检测提供可靠的基础。
6. 重复步骤 4 的洗板操作，进一步去除未结合的物质，确保实验结果不受杂质干扰。
7. 每孔加显色剂 A 50μl，显色剂 B 50μl，振荡混匀后，置 37℃避光显色 15 分钟，使颜色变化充分体现 5 - HT 的浓度。最后每孔加终止液 50μl，用酶标仪读数，取波长 450nm，先用空白对照孔调零点，然后测定各孔光密度值（OD 值）。

九、结果计算

检测完成后，以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD 值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数 Logistic 曲线拟合（4 - pl），创建标准曲线方程。通过样本的吸光度（OD 值），利用方程计算样品的浓度值。若样品被稀释，通过上述方法测得的浓度值要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。

十、试剂盒性能指标

1. 物理性能：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；所有组分应无包装破损，各组分装量不少于组分表中要求，确保试剂盒在外观和物理状态上符合实验要求，保证实验的顺利进行。
2. 剂量反应曲线线性：用四参数 Logistic 曲线拟合（4 - pl），剂量 - 反应曲线相关系数（r）的绝对值应不低于 0.9900，表明试剂盒具有良好的线性关系，能够准确反映 5 - HT 浓度与吸光度之间的关系，实验结果可靠。
3. 精密度：批内精密度要求三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估，批内变异系数 CV% 小于 15%；批间精密度要求三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估，批间变异系数 CV% 小于 15%，体现了试剂盒在不同条件下的稳定性和重复性，保证实验结果的可靠性和可重复性。
4. 灵敏度：最低检出限应不高于 10 pg/mL，能够检测出低浓度的 5 - HT，满足科研对灵敏度的要求，可用于检测微量的 5 - HT 含量变化。
5. 回收率：三组已知的高、中、低浓度样品，进行五次在同一个板块内回收率评估，回收率在 85% - 115% 之间，说明试剂盒的检测结果具有较高的准确性和可靠性，能够较为准确地反映样品中 5 - HT 的实际含量。
6. 稳定性：在 2℃ - 8℃保存，有效期为 6 个月，保证了试剂盒在一定时间内的性能稳定，方便科研人员在有效期内合理安排实验。
7. 检测范围：150 - 2400 pg/mL，能够覆盖一定浓度范围的 5 - HT 检测，满足不同科研需求，为科研工作提供了更广泛的应用空间。

遵循上述使用说明，科研人员能够规范、准确地使用人 5 羟色胺（5 - HT）ELISA 定量检测试剂盒，为科研工作提供可靠的数据支持，助力相关领域的研究和发展。返回搜狐，查看更多