人肝癌细胞HepG2是一种源自一名15岁白人男性肝细胞癌患者的细胞系，具有上皮样形态和贴壁生长特性。这些细胞在体外培养时表现为紧密连接成片状增殖的小岛状结构，并且具有高增殖率。HepG2细胞系广泛应用于肝癌研究、药物代谢和毒性评估等领域，是研究肝功能和疾病的重要工具。
HepG2细胞表达多种肝特异性蛋白和受体，如甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、胰岛素受体和IGFⅡ的受体等。此外，它们还表达3-羟基-3-甲酰辅酶A还原酶和肝甘油三酯脂肪酶活性。[2,3]
HepG2细胞在培养过程中需要特定的条件，如使用含有10%胎牛血清的培养基，并且对培养液的pH值和血清质量要求较高[3]。这些细胞通常在37℃、95%空气和5%二氧化碳的环境中培养。
尽管HepG2细胞具有许多优点，例如无限增殖、稳定表型和易于操作，但其代谢功能表达可能较低，因此在某些代谢研究中可能不如原代肝细胞[1]。然而，由于其成本低、易处理且易于获取，HepG2细胞仍然是肝癌研究中不可或缺的模型[1]。
总之，HepG2细胞系在肝癌研究中扮演着重要角色，其独特的生物学特性和广泛的应用使其成为肝癌研究的重要工具。
HepG2细胞系的起源和历史背景是什么？
HepG2细胞系的起源和历史背景可以追溯到1975年，当时从一名15岁的阿根廷白人男孩的肝肿瘤活检中获得[13]。这些肿瘤组织最初被描述为肝细胞癌（HCC），但后来的研究发现，它们实际上是一种肝母细胞瘤（HB）[12]。这一错误分类导致了长达30年的混淆，直到Lopez-Terrada等人对HepG2的性质进行了调查后才得以纠正[12]。
HepG2细胞系因其独特的功能特性而广泛应用于科学研究，包括血浆蛋白的合成和分泌、胆固醇和三酰甘油代谢、脂蛋白代谢和运输、胆汁酸合成以及糖原合成等[15]。此外，它还被用于药物代谢、人类毒理学、癌症研究、肝脏疾病、基因调控机制和生物标志物发现等领域[14]。
尽管HepG2细胞系具有许多优点，如几乎无限的寿命、稳定的表型、高可用性和易于操作等，但它也存在一些缺点。例如，其药物代谢酶和转运蛋白的表达有限，大多数药物代谢CYP基因的表达丰度较低，并且经过长期培养后，该细胞系的蛋白表达水平会产生差异，这可能影响实验数据的重现性[15]。
HepG2细胞在药物代谢和毒性评估中的具体应用案例有哪些？
HepG2细胞在药物代谢和毒性评估中的具体应用案例包括以下几个方面：
药物代谢研究：
- CYP酶表达增强的HepG2细胞：通过使用腺病毒转导技术，使HepG2细胞表达特定的细胞色素P450（CYP）酶，如CYP2C9、CYP3A4等，可以增强这些细胞对药物代谢的研究能力。例如，在一项研究中，通过增强CYP酶表达的HepG2细胞被用于评估药物代谢物的变化，并预测药物相互作用[18]。
- 药物代谢途径的研究：HepG2细胞被用于研究特定的代谢途径，例如乙硫胺的代谢过程。通过控制细胞系中甲硫氨酸的氧化情况，可以推断出HepG2细胞的一级和二级代谢酶的作用[17]。
毒性评估：
- 药物诱导的肝损伤（DILI） ：利用HepG2细胞表达单一或多种CYP酶，结合高通量筛选（HCS）策略，可以评估代谢依赖型药物毒性，并识别易感代谢表型。例如，研究表明，当HepG2细胞表达高水平的CYP酶时，对生物激活药物的敏感性增加[20]。
- 常规镇静剂和阿片类药物的肝毒性测试：使用HepG2/C3A细胞系，一种高度功能性的HepG2克隆衍生细胞系，可以测试常规使用的镇静剂和阿片类药物的肝毒性。这些细胞系能够合成大部分血浆蛋白，并且具有较高的生理反应性和代谢标记物，使其成为预测人类肝毒性的有效工具[21]。
- 药物引起的肝损伤预测：通过将五种肝毒性药物处理于WT-HepG2细胞和CYPs–UGT1A1 KI-HepG2细胞中，发现后者对药物引起的肝毒性更敏感，从而验证了其在预测药物引起的肝损伤方面的应用价值[18]。
其他应用：
- 药物代谢酶水平及其诱导情况的研究：研究了不同药物对HepG2细胞的影响，如二甲基亚砜、山茶花提取物、托吡酯等，以及这些药物对细胞存活率、线粒体功能和葡萄糖代谢的影响[16]。
- 药物代谢和毒性筛选：HepG2细胞被广泛用于药物代谢和毒性筛选，特别是在初步筛选候选药物化合物时。例如，通过检测特定化合物对CYP特异性底物的抑制作用和细胞活性变化，可以评估化合物的时间和浓度依赖性抑制和毒性[19]。
总之，HepG2细胞因其稳定性和易于操作的特点，在药物代谢和毒性评估中具有广泛的应用前景。
HepG2细胞与原代肝细胞在代谢功能表达上的差异具体表现在哪些方面？
HepG2细胞与原代肝细胞在代谢功能表达上的差异主要体现在以下几个方面：
药物代谢酶的表达：
- CYP酶：HepG2细胞中CYP3A4等酶的表达水平显著低于原代肝细胞，这些酶在药物代谢中起关键作用[12]。例如，CYP3A4在HepG2细胞中的表达仅为肝细胞的100-400倍[12]。
- UGT家族酶：HepG2细胞中UGT家族酶（如UGT1A1、UGT1A4、UGT1A6、UGT2B7、UGT2B15和GSTM1）的表达要么非常低，要么完全缺失，这些酶在代谢多种抗癌剂中起着关键作用[12]。
- SULT酶：SULT1A1和SULT2A1在肝细胞和HepG2细胞中的浓度没有明显差异，但在50%的HCC病例中，SULT2A1的水平有所下降[12]。
转运蛋白的表达：
- BSEP蛋白：HepG2细胞中BSEP蛋白的水平仅为肝细胞的1/100[12]。
- MRP转运蛋白：MRP4在HepG2细胞中未检测到，而MRP3和MRP6的水平仅为肝细胞的4-20倍[12]。
基因表达和代谢途径：
- 基因表达差异：HepG2细胞中许多与药物和异物代谢相关的基因表达变化，这可能影响药物代谢分析的准确性和相关性[22]。例如，HSD17B6和HSD17B13基因在肝细胞系中的表达水平低于原代肝细胞[22]。
- 脂质代谢：HepG2细胞系中乙酸、肌酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的水平升高，表明脂质代谢存在差异[12]。
细胞能量代谢：
- HepG2细胞在细胞能量代谢方面与原代肝细胞有所不同，例如，HepG2细胞在胆固醇分泌方面显著减少[23]。
其他代谢功能：
- HepG2细胞保留并放大了与内源性和外源物质代谢相关的系统变化，这些变化与肝母细胞瘤和肝细胞癌细胞相似[12]。
如何优化HepG2细胞的培养条件以提高其代谢功能表达？
为了优化HepG2细胞的培养条件以提高其代谢功能表达，可以参考以下几点：
培养基选择和成分调整：
- 使用含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM或RPMI-1640培养基是常见的做法[26,29,31]。为了进一步优化代谢功能，可以考虑添加特定的代谢调节剂，如谷氨酰胺和G418等[27]。
气体环境和温度控制：
- 细胞应在37°C、5% CO2的湿润环境中培养[26,31]。此外，缺氧预处理和复氧阶段的控制也对代谢功能有显著影响，可以通过模块化培养箱实现[27]。
三维培养条件：
- 三维培养条件，如使用CVM室在液-固、液-液和液-气界面培养，可以显著提高HepG2细胞的肝功能表现，包括白蛋白分泌、尿素合成和CYP3A4活性水平[34]。此外，使用混合水凝胶（如PC4/Cultrex）的比例优化也有助于细胞增殖和分化[30]。
代谢物平衡和测量：
- 在培养过程中，定期测量细胞外代谢物的浓度，如葡萄糖、乳酸、氨基酸等，可以帮助了解细胞代谢状态，并通过高通量液相色谱等方法进行定量分析[28]。
基因修饰和药物处理：
- 对HepG2细胞进行基因修饰，如敲除或敲入特定基因，可以增强其代谢功能。例如，表达TRET1蔗糖转运体和AfrLEA2基因的HepG2细胞在代谢实验中表现出更好的性能[27]。此外，药物处理，如使用利拉鲁肽等药物，也可以显著改善细胞的代谢功能[24]。
细胞密度和传代条件：
- 细胞密度达到80%-90%时进行传代培养是常规操作。此外，调整接种密度和培养时间，如7.5x10^3个/孔的接种密度和7-8天的培养时间，可以获得高质量的多向分化体（MCTS），从而提高细胞的代谢功能[25]。
HepG2细胞系在肝癌研究中的局限性有哪些，以及如何克服这些局限性？
HepG2细胞系在肝癌研究中具有广泛的应用，但其局限性也不容忽视。以下是HepG2细胞系在肝癌研究中的主要局限性及其克服方法：
局限性
HepG2细胞系与正常肝细胞相比，肝脏关键代谢酶的表达水平较低，通常具有较低的代谢能力[32]。这使得HepG2细胞系在预测肝毒性化合物的代谢和消除时存在局限性。
HepG2细胞系与正常肝细胞存在显著差异，例如P450基因的改变。此外，HepG2细胞系中的CTNNB1基因突变与肝癌的高发有关，而这些突变在正常肝细胞中并不常见[12]。
即使来自同一细胞系的样本之间也存在显著差异，这可能是由于交叉感染和支原体感染所致[12]。这种异质性限制了其作为癌症模型的预测价值。
HepG2细胞系参与物质代谢的关键蛋白质表达不足，且缺乏吸收转运体和第一相酶[12]。这表明在预测肝细胞中外来物质的代谢和消除时需谨慎使用该细胞系。
HepG2细胞在形态上与正常肝细胞相似，但其线粒体和内质网发育较差，数量减少，且结构异常[12]。这些结构上的差异可能影响细胞的功能和代谢活性。
克服方法
为了克服HepG2细胞系代谢能力较低的问题，可以考虑使用其他肝癌细胞系如HepaRG，该细胞系表达更多的Ⅱ相代谢酶和更高的膜转运蛋白活性[32]。
建立三维球形细胞培养系统，这种方法将细胞转化为球形，创建了一个更接近生理系统的系统，使3D球形HepG2模型的代谢活性，包括细胞色素，高于二维细胞，更接近正常肝细胞[12]。
通过基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）对HepG2细胞进行修饰，提高其关键代谢酶的表达水平，使其更适合作为肝细胞模型[12]。
结合多种肝癌细胞系进行研究，以减少单一细胞系带来的偏差。例如，结合HepG2和其他肝癌细胞系（如Huh7）的研究结果，可以提供更全面的数据支持[33]。
在体外实验的基础上，进一步在体内模型中验证化合物的有效性。例如，在小鼠肝癌模型中测试候选药物的效果，以确保体外实验结果的可靠性[33]。
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